大鼠实验性牙移动中Integrin－αm的表达变化

乔 婷，陈 杰

(青岛大学医学院，山东 青岛 266071;青岛大学医学院附院，山东 青岛 266071)

错牙合畸形是口腔科的常见病多发病，错牙合畸形正畸治疗可造成牙周、牙体、咀嚼肌、颞下颌关节等组织结构的损伤。患者临床表现为自发痛、触痛、痛觉过敏等症状和体征。疼痛的产生是正畸治疗中最常见和最棘手的问题，疼痛令人产生不愉快的感觉，从而使患者惧怕正畸治疗，有的甚至放弃正畸治疗。正畸治疗所导致的口面痛是临床口腔科常见的慢性疼痛。疼痛通常在加力几小时后出现，持续几天后消失。目前对正畸致痛机制的研究大多局限于牙周组织内的神经改变，而对初级感觉神经元胞体及其中枢端改变的研究很少。传导口腔颌面部疼痛的初级感觉神经元位于三叉神经节(TG)，其树突伸向外周组织，感觉外周刺激;中枢突将外周信息传至三叉神经脊束核尾侧亚核(Vc)，在此中继后传至上位脑中枢，完成初级感觉信息的传递。因此，探讨在正畸加力状态下，这些神经元上特异表达的受体、通道或信号转导分子发生的可塑性变化，有助于阐明正畸疼痛的发病机制。慢性疼痛是近年来研究的热点，寻找正畸疼痛的发生机制及变化规律可以有效地减轻治疗过程中的疼痛，同时也体现医学的人文关怀。炎症在其中扮演着重要角色。整合素(integrin)是细胞表面粘附分子中的一大家族，是一类细胞膜表面糖蛋白，介导细胞与细胞、细胞外基质的相互识别与粘附，并参与细胞分化、炎症反应［1-2］、创伤愈合等过程［3-4］。为研究整合素在牙移动动物模型慢性痛中的作用及作用机制，本实验应用免疫组织化学方法，对三叉神经节、脑干三叉神经脊束核、大脑皮层中的Integrin－αm进行检测，对Integrin－αm在慢性痛中的作用及其可能性进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 实验对象 成年雄性SD大鼠60只，体重为180～220 g，清洁级，由菏泽医学专科学校实验动物中心提供。所有动物生长发育完全、体格健壮，牙齿大小适中、牙龈情况良好。于实验前置于实验室适应环境一周，自由进食、饮水;室温控制在23±2℃，自然光照。采用随机分组方法将大鼠分为实验组(n=30)和对照组(即术后0h组，n=30)。根据加力持续时间再随机分为术后 1d、2d、3d、4d、5d 亚组(n=6);对照组大鼠不做任何干预。分组见表1。

表1 实验动物分组(只)

1.2 仪器与试剂 亚鹏牌CS－IV型摊片烤片机，由孝感市宏业医用仪器有限公司生产;Leica RM2015石蜡切片机由德国徕卡公司制造;光学显微镜;O-lympus兔抗大鼠integrin－αm多克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供;即用型SABC免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供;DAB染液由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.3 牙齿移动动物模型的制备 实验组将镍钛螺旋弹簧置于大鼠右侧上颌第一磨牙与上切牙之间，用直径为0.25 mm的不锈钢结扎丝将弹簧的一端结扎于磨牙颈部，另一端结扎于两个切牙上，并用优质双重固化粘结剂固定，使弹簧拉伸，力量控制为50 g，这样磨牙受到近中方向的拉力，以切牙作支抗，形成大鼠磨牙近中移动的动物模型［5-8］。严密监控大鼠矫治器，若有损坏或脱落，及时更换安装。加力装置如图1。

图1 大鼠牙移动示意图

1.4 实验方法 1)石蜡切片的制备:各组大鼠各6只在给定时间点断头，分别取出双侧三叉神经节，脑干和大脑组织，置于4%甲醛溶液后固定2 h，蒸馏水浸泡10 h。常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。自视交叉后方开始连续冠状位切片，厚度6 μm，贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上，4℃保存备用。2)免疫组织化学方法(SABC法):integrin－αm多克隆抗体，即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB染液购于武汉博士德生物工程有限公司。严格按说明书染色步骤操作。光镜下观察胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞。阴性对照切片不加一抗，用0.01 mol/L PBS代替，不出现阳性反应。每只大鼠取4张连续切片，在200倍光镜下观察三叉神经节，脑干三叉神经脊束核和大脑皮质区，随机4个视野，用LEICA Qwin图像处理与分析系统(Leica公司)分析各个视野的光密度值(OD)。

1.5 统计学处理 采用SPSS12.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较用方差分析，两组均数间比较用t检验。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果 200倍光镜下，实验组和对照组的三叉神经节、脑干三叉神经脊束核及大脑皮质区均可检测到Integrin－αm的表达，Integrinαm阳性信号呈棕色颗粒，主要分布在细胞浆中，部分在细胞核中。对照组Integrin－αm的表达极其微弱，随着牙齿受力移动时间延长，实验组Integrinαm的阳性表达明显增加，无论三叉神经节、脑干三叉神经脊束核，还是大脑皮质区，其阳性细胞数量增多，染色加深。(图 2，3，4)。

图2 三叉神经节内Integrin－αm的阳性细胞表达，免疫组化染色 ×200(实验 0d，1d，2d，3d，4d，5d)

图3 脑干三叉神经脊束核内Integrin－αm的阳性细胞表达，免疫组化染色 ×200(实验 0d，1d，2d，3d，4d，5d)

图4 大脑皮层内Integrin－αm的阳性细胞表达，免疫组化染色 ×200(实验 0d，1d，2d，3d，4d，5d)

2.2 图像分析 200倍光镜下，在对照组的三叉神经节、脑干三叉神经脊束核及大脑皮质区均可检测到Integrin－αm的微弱表达，其OD值较低，三个区域相比没有显著差别(P ＞0.05，表2，3，4)。Integrin－αm阳性信号呈棕色颗粒，主要分布在细胞浆中，部分在细胞核中有表达。正畸治疗加力能诱导Integrin－αm的表达增加，随着时间的延长(1d～5d)，实验组Integrin－αm的阳性表达明显增加，无论三叉神经节、脑干三叉神经脊束核，还是大脑皮质区，其OD值均随之明显升高，与对照组比较差别有统计学意义(P ＜0.01)。

表2 三叉神经节内实验组和对照组免疫组化染色平均光密度值(x±s)

表3 脑干三叉神经脊束核内实验组和对照组免疫组化染色平均光密度值(x±s)

表4 大脑皮层内实验组和对照组免疫组化染色平均光密度值(x±s)

3 讨论

正畸临床治疗是通过对错位的牙，牙弓或合页骨施加一定的矫治力来达到矫治畸形的目的，伴随着很多机体的反应，疼痛的产生是正畸治疗中最常见的问题之一，也是正畸工作急需解决的问题。因此疼痛一直是学者关注的焦点.炎症是组织对创伤的反应中扮演着重要的作用。1987年Hynes［9］首先报道:整合素是一类跨膜糖蛋白，由α与β两个亚单位在细胞表面经非共价键形式连接而成。整合素(integrins)是介导破骨细胞与细胞外基质识别与黏附的重要因子，直接影响牙齿移动［10］。

正常情况下整合素无活性，在激素、细胞因子、细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)等刺激下其构型及亲和力发生改变而具活性。活化的整合素有多种功能，主要是黏附和信号传导两大功能，调节细胞形态、增殖、趋化、迁移、凋亡。其胞外区通过识别配体而介导细胞黏附于ECM;胞内区与细胞骨架蛋白形成形态学上的黏着斑，并与细胞骨架相连，形成配体－整合素－细胞骨架跨膜信息系统，从而将ECM与细胞骨架连接起来介导双向信号传导。

正畸牙齿的移动依赖于牙周组织的改建过程，其中牙槽骨的改建尤为重要。牙槽骨的改建是受众多因素影响的极复杂过程，局部生长因子如VEGF、TGF－β、bFGF等的作用已经十分肯定。目前研究认为在牙周炎症的破坏机制中，整合素发挥了重要作用。参与牙周组织改建的主要功能细胞有:破骨细胞、成骨细胞及成纤维细胞。目前在破骨细胞上鉴定出的整合素主要有 αvβ3、α2β1和 αvβ13 种，可介导破骨细胞与骨基质蛋白(骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白和纤连蛋白)的黏附，促进其分化和成熟，活化其骨吸收功能。在靠近骨质表面破骨细胞的细胞质和细胞膜分化成两个区，共同构成骨吸收装置，此装置的形成也有赖于整合素与特异骨基质蛋白间的相互作用。Talic等［11］发现正畸牙移动过程中整合素αvβ3在破骨细胞表面大量表达，促进骨吸收作用。正常人成骨细胞上的整合素有 α3β1、α4β1、α5β1和 αvβ3。Schneider等［12］通过添加α5或β1的抗体使成骨细胞矿化反应减少20% ～45%，添加αvβ3的抗体成骨细胞矿化反应约减少65%，拮抗α3β1成骨细胞矿化反应减少近95%，这说明整合素调节的黏附和信号传导促进了成骨细胞的渐进分化，及其与矿化基质的黏附。成纤维细胞是牙周膜中的主要功能细胞，其与ECM的黏附是牙周组织再生及创伤修复的重要过程。牙周膜和牙龈成纤维细胞表达 α2、α5、β1、αvβ3，对介导成纤维细胞的黏附、分化和成熟是十分必要的［13］。体外实验拮抗β1能明显抑制牙周膜和牙龈成纤维细胞黏附到釉基质蛋白上，可见整合素参与了釉基质蛋白和牙周膜及牙龈成纤维细胞的相互作用［14，15］。可见整合素在牙周组织改建中具有调节激活各种牙周细胞，促进牙周组织改建的功能。

研究结果表明，在对照组的三叉神经节、脑干三叉神经脊束核及大脑皮质区均可检测到Integrinαm的微弱表达，其OD值较低，三个区域相比没有显著差别。正畸创伤能诱导Integrin－αm的表达增加，随着时间的延长(1d～5d)，实验组Integrin－αm的阳性表达明显增加，与对照组比较差别有统计学意义(P＜0.01)。说明 Integrin－αm 参与了错牙合矫正术后炎症过程，这一过程不仅仅与牙周组织的激活和改建有关，更重要的是引起上级神经元(脑干三叉脊髓束核乃至大脑皮层相应区)及传导通路的功能发生改变。在以往对人正畸牙移动疼痛的研究中发现，3.4%的患者在放置弓丝后立即有牙痛，少数在2～3 d才出现症状，疼痛一般持续5～7 d，其中在加力2～3 d后疼痛最严重，这与本实验得出的Integrin－αm阳性表达变化相似。因此，本动物实验可在一定程度上反应人正畸牙移动时伤害信息的传递过程，Integrin－αm在其中产生的重要作用。调节Integrin－αm的表达水平可能有助于改善错牙合矫正术后局部和全身炎症反应，也为临床研治新型镇痛药物提供了新的靶点。

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