枳壳中脂溶性部位有效成分提取工艺的研究

陈海芳， 魏 玲， 袁金斌， 王发英， 黎艳刚， 涂明珠， 杨武亮

(江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌330004)

枳壳为芸香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培变种的干燥未成熟果实，具有理气宽中，行滞消胀的功效［1］。为了进一步探讨枳壳中理气作用的活性化学成分，笔者对枳壳脂溶性部位提取物进行了进一步的研究，初步表明脂溶性部位提取物对胃肠平滑肌有双向调节作用，小剂量对正常小鼠胃肠运动有促进作用，大剂量则有抑制作用。枳壳中脂溶性部位成分主要为多甲氧基黄酮和香豆素类有效成分，文献报道这些脂溶性成分对肺癌、结肠癌、胃癌［2-5］等多种癌细胞株等具有较强的抑制作用，以及抗菌、抗氧化、神经保护活性［6-8］。为了有效开发和利用枳壳，本实验主要以枳壳中的meranzin hydrate、马尔敏、川陈皮素、红橘素和葡萄内酯的含量以及脂溶性部位浸膏得率为评价指标，采用L9(34)正交实验对枳壳的脂溶性部位化学成分的提取工艺进行了研究，以期为枳壳中脂溶性部位成分的大规模化生产工艺提供理论依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪(包括四元泵、柱温箱、VWD检测器和 Agilent 1200色谱工作站);瑞士梅特勒AE-240十万分之一电子天平。

1.2 试药 甲醇为色谱纯(Merk公司);其它试剂均为分析纯;水为重蒸水。meranzin hydrate、马尔敏、川陈皮素、红橘素和葡萄内酯等对照品均为自制，结合光谱(1H-NMR，13C-NMR以及ESI-MS)确定结构，HPLC峰面积归一化法计算质量分数≥98%。枳壳样品采自江西新干，由江西中医学院杨武亮教授鉴定为新干臭橙枳壳。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇(A)-水(B)梯度洗脱，A:0～7 min，51%;7～9 min，59%;9～14 min，60%;14～15 min，64%;15～25 min，64%;25～29 min，95%;29～30 min，100%;30～36 min，100%;流速:1 mL/min;柱温:30℃;检测波长:324 nm;进样量10 μL;理论塔板数按照meranzin hydrate计算应不低于5 000，色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的配制

取meranzin hydrate、马尔敏、川陈皮素、红橘素和葡萄内酯适量，精密称定，同置于50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，静置，制成混合对照品标准溶液，其中含 meranzin hydrate 427.4 μg/mL、马尔敏170.6 μg/mL、川陈皮素 206.8 μg/mL、红橘素208.0 μg/mL、葡萄内酯 203.8 μg/mL。

2.3 线性范围考察

分别精密吸取此混合标准溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0 mL置于25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀。在上述色谱条件下，分别进样10 μL，测定峰面积。以对照品浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算回归方程。结果见表1。

图1 对照品(A)和供试品(B)的HPLC图

表1 标准品的线性方程

2.4 精密度测定

精密吸取同一浓度的混合对照品溶液，连续进样6 次，每次10 μL，以 meranzin hydrate、马尔敏、川陈皮素、红橘素和葡萄内酯的峰面积计算，RSD分别为2.14%、2.20%、2.14%、2.19%、2.48%(n=6)，结果表明精密度良好。

2.5 供试品制备

取枳壳粗粉约10 g，精密称定，采用水浴回流法，按照实验设计进行提取，趁热过滤，减压浓缩至干，得总浸膏。总浸膏以50 mL水溶解分散成悬浮液，以50 mL氯仿萃取3次，萃取液合并，减压浓缩至干，得脂溶性部位浸膏，称重，并计算得率。

2.6 供试品测定

将上述所得脂溶性部位浸膏以甲醇溶解，置于50 mL量瓶中，定容，摇匀，过0.45 μm膜，取续滤液作供试品溶液。上述色谱条件下，分别进样10 μL，测定，计算5种脂溶性成分的含量，并以5种成分的含量之和作为样品脂溶性部位成分含量的指标。

2.7 正交实验

在实际操作中，提取效果往往受到多因素的影响，为了全面考察提取效果，本研究以乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数为考察因素，选用L9(34)正交表对枳壳中的脂溶性部位成分提取工艺进行筛选，详见表2。

表2 脂溶性部位成分提取正交实验因素水平表

表3 L9(34)正交实验

3 实验结果

3.1 极差分析 从表3可以看出，以脂溶性部位化学成分的含量为考察指标，各因素影响大小依次为:D＞B＞C＞A，即提取次数对提取的影响较大，其次是物料比，提取时间和乙醇浓度;以脂溶性部位浸膏得率为考察指标，各因素的作用主次为A＞D＞C＞B，即依次为乙醇浓度，提取次数，提取时间，物料比。

3.2 方差分析 将所得实验结果进行方差分析，结果见表4和表5。方差分析结果表明:以脂溶性部位化学成分的含量为考察指标，提取次数有显著影响(P＜0.05)，其他因素无显著意义(P＞0.05)，以A3B2C2D2为佳;以脂溶性部位浸膏得率为考察指标，四种因素均无显著影响(P＞0.05)，以A3B2C2D3为佳。

从表2中因素的K值来看，85%和95%乙醇的提取效果以及提取2次和3次的效果相差并不大，从大工业生产和节约成本上考虑，以85%、提取2次为宜。因此根据极差和方差分析结果，枳壳脂溶性部位成分优化后的工艺定为A2B2C2D2，即:乙醇浓度85%、料液比1 ∶8、提取时间1 h，提取2次。

3.3 正交实验验证 为进一步验证优选方法的可靠性，取3份药材，按照筛选出的工艺进行提取，计算脂溶性部位各指标成分的含量及脂溶性部位浸膏得率，3次平行验证性实验表明脂溶性部位成分的平均含量为2.86(mg/g)，RSD为1.32%，脂溶性部位浸膏的平均得率为2.81%，RSD为1.78%，具体见表6，表明该工艺稳定、可行、重复性好。

表4 脂溶性部位成分含量方差分析

表5 脂溶性部位浸膏得率方差分析

表6 正交实验验证(n=3)

4 讨论

4.1 本实验首次对枳壳的脂溶性部位成分提取工艺进行了研究，该提取工艺简单，条件易控制，提取率高，可为枳壳的脂溶性部位成分的制备及大规模生产提供理论依据。

4.2 本实验采用了单因素实验考察了乙醇浓度、物料比、提取时间和提取次数四个因素，选取因素中脂溶性部位成分的含量及脂溶性部位浸膏得率较高的三个条件作为正交实验水平设计的参考依据。

4.3 萃取次数对脂溶性成分萃取率的影响 按照优化后的提取工艺，做3个平行实验，分别萃取4次，测定氯仿相和水溶液里残留的脂溶性成分的量，计算其萃取率，依次为 63.1%、22.6%、7.9%、3.4%，水里残留有3.0%的脂溶性成分的含量。据此可以看出，氯仿萃取3次可萃取出含93%以上的脂溶性成分，从生产成本上考虑，以氯仿萃取3次为宜。

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