利用酶解法测定复合维生素溶液中维生素A含量的研究

2010-01-27赵小华吴桂英寇贺红郑彦丽赵桂廷

饲料工业 2010年6期

赵小华吴桂英寇贺红郑彦丽赵桂廷

赵小华吴桂英寇贺红郑彦丽赵桂廷

建立碱性蛋白酶-高效液相色谱法测定复合维生素溶液中维生素A的含量。利用碱性蛋白酶的方法处理样品，并采用 EcoSic HPLC Coumw-ODS，C18 柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）分离,检测波长为326 nm，流动相为甲醇+水（95+5）等高效液相色谱条件检测样品中维生素A的含量。结果显示，样品中维生素A与其他组分分离良好，维生素A浓度在120～600 IU/ml范围内线性关系良好（r=0.999 7）,平均回收率在99.9%（n=5）,RSD为1.0%。本方法简便、快捷，结果准确、可靠、重现性好，可作为企业控制生产过程中复合维生素溶液质量的方法之一。

碱性蛋白酶；高效液相色谱法；复合维生素溶液；维生素A

维生素A（Vitamin A）又称视黄醇，是1913年美国化学家台维斯从鳕鱼肝中提取得到一种不溶于水，易溶于脂肪、油等有机溶剂的黄色粉末。其主要生理功能包括：维持视觉、促进生长发育、维持上皮结构的完整与健全、加强免疫能力、清除自由基等。因此常作为补充动物营养、提高生产性能的维生素之一。1999年国家质量技术监督局颁布的国家标准——饲料中维生素A的测定适用于复合维生素预混料中维生素A的测定。由于饲料中成分复杂，样品前处理需要经过一系列的皂化、提取、浓缩等方法处理，最后采用高效液相色谱法测定维生素A含量虽然很好，但是由于复合维生素预混料成分相对简单，再利用该法控制质量，其操作过程不仅费时费力，而且检测结果的精确性还与检测人员实验技能操作熟练程度有关。因此国内饲料添加剂企业想通过寻找一种简便、快捷、可靠的方法测定复合维生素预混料中维生素A的含量。

1 仪器与试剂

1.1 仪器与色谱条件

高效液相色谱仪:Agilent Technologies 1200series；色谱条件：色谱柱EcoSic HPLC Coumw-ODS、C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）、检测波长 326 nm、流动相为甲醇+水（95+5）、流速为 2.0 ml/l、进样量为 10 μl、柱温35℃；万分之一分析天平：Sartorius Bs224s。

1.2 试剂

对照品为维生素A乙酸酯：批号K0210906,100万IU/ml，中国兽药监察所；碱性蛋白酶：批号090926，10万IU/g，浙江海宁金潮实业有限公司；复合维生素溶液（主要成分为VA、VD、VE，标示量分别为 12 000、8 000、8 IU/ml）：批号 091030、091108、091125，佛山市南海东方澳龙制药有限公司生产；空白样品（不含主要成分的复合维生素溶液，自制）；10%氨水溶液（自制）；纯化水（自制）；无水乙醇（分析纯）；甲醇（色谱纯）。

2 方法和结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取对照品（维生素A乙酸酯）60 mg置100 ml的棕色容量瓶中，精密量取10 ml的10%氨水溶液置棕色容量瓶中，再加50 ml的无水乙醇，超声使其溶解，再精密称取碱性蛋白酶1 g加入到棕色容量瓶中，振摇，用无水乙醇稀释至刻度后在超声10 min,先用滤纸过滤，再用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取过滤液即得，图1为对照品的HPLC图谱。

2.2 供试品溶液的制备

精密量取复合维生素溶液5 ml到100 ml棕色容量瓶中，精密量取10 ml的10%氨水溶液置棕色容量瓶中，再加50 ml的无水乙醇，超声使其溶解，再精密称定碱性蛋白酶1 g加入到棕色容量瓶中，振摇，用无水乙醇稀释至刻度后在超声10 min,先用滤纸过滤，再用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取过滤液即得供试品溶液，图2为供试品的HPLC图谱。

2.3 空白实验

精密量取空白样品5 ml，分别按照2.2项方法处理样品，结果见图3。结果显示空白样品对该系统没有干扰。

2.4 线性关系考察

精密称取 2.1 节对照品溶液 1、2、3、4、5 μl分别注入液相色谱仪，以色谱峰面积（Y）为纵坐标，进样量（μl，X）为横坐标绘制维生素A乙酸酯标准曲线，并得出回归方程Y=230.2X+48.4（R=0.999 7），维生素A乙酸酯在120～600 IU/ml的范围呈良好线性关系，标准曲线见图4。

图1 对照品维生素A乙酸酯的HPLC图谱

图2 复合维生素溶液中维生素A的HPLC图谱

图3 空白样品的HPLC图谱

图4 对照品维生素A乙酸酯标准曲线

2.5 精密度实验

精密吸取对照品溶液10 μl，连续进样5次测定其峰面积，根据连续进样5次测定的峰面积，计算出RSD=0.40%。

2.6 稳定性实验

取同一批号供试品溶液按1.1节色谱条件0、10、20、30、50 min、1 h、2 h 进样，分别测定其峰面积（见表1）。经过在不同时间点测定样品的峰面积值，结果表明，样品在2 h内无明显的变化,说明实验过程中样品的稳定性良好。

表1 供试品稳定性实验结果

2.7 重现性考察

精密量取同一批号供试品5 ml共6份，按照2.2项下制备供试品溶液，和1.1项下色谱条件测定维生素A的含量，结果见表2。

表2 供试品重现性考察结果

通过连续6次测定样品的峰面积值，利用对照品比值法计算出的结果表明重现性良好。

2.8 回收率实验

精密量取复合维生素溶液5 ml，添加已知准确含量的维生素A乙酸酯原料0.06 g（精确至0.000 2 g），测定其回收率，结果见表3。

表3 维生素A乙酸酯回收率实验结果

由表3可知，样品的平均回收率为99.9%（RSD=1.0%），说明通过酶解法测定复合维生素溶液中维生素A具有良好的回收率。

2.9 样品含量测定

分别精密量取3个批号的供试品各5 ml和对照品（维生素A乙酸酯）60 mg，分别按照2.2节和2.1节方法制备供试品溶液和对照品溶液，并按照1.1节色谱条件检测维生素A的含量，结果见表4。

表4 3批供试品中维生素A含量的测定结果

3 讨论

3.1 测定方法的选择

复合维生素预混料的传统检测方法样品前处理需要经过一系列的皂化、提取、浓缩等方法处理，最后采用高效液相色谱法测定维生素A含量虽方法很好，但其操作过程不仅费时、费力，而且检测结果的精确性还与检测人员实验技能操作熟练程度有关。参考郭芙蓉等（2006）和蒋一昕（2003、2005）的研究方法和维生素A乙酸酯微粒的检测方法，并经过长期不断的实践，结果发现，采用碱性蛋白酶酶解处理复合维生素预混料后，采用高效液相色谱法测定维生素A含量不仅简便快捷，而且结果准确、可靠。