微乳薄层色谱用于糖分离的研究*

孙 悦 张 茜 毕静文 李君杏

(1.广东药学院中药学院,广州 510006； 2.淄博市中医医院，淄博 255300)

多糖具有复杂多样的生物活性和功能，多糖的单糖组成测定是控制多糖质量标准和提供多糖基本信息的重要环节。因单糖存在互变异构体、差向异构体、结构相似等特征，必须采用高效的分离技术方可实现系列单糖的有效分离[1]。

微乳液是由乳化剂、助乳化剂、油相和水相组成的光学上各向同性、热力学稳定的液-液分散体[2]，只要组分的比例合适即可自发形成均匀透明或微呈乳光的体系并保持稳定。以微乳液为流动相进行的色谱称为微乳色谱[3]。根据胶束色谱理论[4]，当流动相中存在胶束及两性表面活性剂,展开系统即具增溶、降低界面张力作用，并且因静电、疏水及立体等效应，使其具有独特的选择性，可同时分离亲水物质和疏水物质，对带电成分和非带电成分亦有较好的分离选择，适用于分离差别很小的物质。已有将微乳液用于薄层分离黄酮[5，6]、生物碱[7，8]、氨基酸[9]等的报道，而把微乳液作为展开剂分离鉴定糖类的研究尚未见文献报道。

薄层色谱在成本、操作、检测、批量分析方面具有独特优越性，而且还可以作为现代色谱分析方法的预行为测试。笔者以十二烷基硫酸钠-正丁醇-正庚烷-水微乳液为展开剂，研究了糖的微乳薄层色谱行为，以期为糖的分析提供新的研究思路。研究结果表明，微乳液作展开剂分离小分子糖可大大减少糖的脱尾现象，有较好的增敏作用，30%～60%微乳液可对糖在硅胶G-0.3 mol/L NaH2PO3-0.5%CMC-Na板上得到较好的分离。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

数显鼓风干燥箱:GZX-9240MBE型,上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

双槽薄层色谱展开缸：10 cm×10 cm，上海信谊仪器厂；

电动喷雾器：YOKO-PN型，武汉药科新技术开发有限公司；

喷雾显色抽气箱：YOKO-PX型，武汉药科新技术开发有限公司；

循环水式真空泵：SHZ-DШ型，巩义市英峡矛华仪器厂；

天平：MP200A型， 0.001 g，上海良平仪器有限公司；

恒温水浴锅：HH-2型，江苏金坛市宏华仪器厂；

D-果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖对照品：上海伯奥生物科技有限公司；

槐米:市售，由广东药学院鉴定为正品；

实验所用化学试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

(1) 薄层板的制备

按1 g硅胶G、3 mL 0.5%CMC-Na的比例加入研钵中研匀,用涂布器涂布，晾干后于105℃烘30 min，于干燥箱中备用。分别配制含有0.1 mol/L硼酸的0.5%CMC-Na溶液以及含有0.3 mol/L NaH2PO3的0.5%CMC-Na溶液，分别制备0.1 mol/L硼酸板、0.3 mol/L NaH2PO3板。

(2)微乳液展开剂的制备

按照文献方法[7]，在保证十二烷基硫酸钠、正丁醇、正庚烷质量比为0.27∶0.63∶0.10的条件下，改变水量，配制系列微乳液。按上述质量比取SDS、正丁醇、正庚烷，于研钵中加适量水研磨,然后加水至足量，混匀，放置24 h，微乳液的成分配比及结构列于表1。

(3)供试品溶液的配制

称取槐花米粗粉20 g(压碎)，加沸水300 mL，加热煮沸30 min，纱布趁热过滤，残渣同法再操作一次，合并两次滤液，室温放置析晶，经结构鉴定为芸香苷，减压抽滤，用蒸馏水洗涤芸香苷，抽干，得粗制芸香苷，置空气中风干。

取粗制芸香苷，加蒸馏水煮沸，全部溶解后，趁热抽滤，冷却析晶后抽滤，得芸香苷精制品，置空气中干燥。

表1 微乳液的成分配比及结构

注：“w/o”为油包水型；“w/o-o/w”为油、水双连续型；“o/w”为水包油型。

取精制芸香苷，研细后加2%硫酸加热回流30 min，此时，瓶中的混浊液逐渐变为澄清的棕黄色液体，最后生成鲜黄色沉淀，放冷沉淀，抽滤，取滤液加饱和氢氧化钡溶液中和至中性，滤去沉淀，滤液于水浴60℃浓缩，加乙醇溶解并定容至10 mL[10]。

(4)对照品溶液的配制

分别精密称取D-果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、蔗糖各10 mg，用70%乙醇定容至10 mL，得各糖的浓度约为10 mg/mL。

(5)糖样品实验

以40%微乳液为展开剂，于室温上行法展开，于硅胶G-0.5%CMC-Na-0.1 mol/L硼酸板上对芸香苷水解糖溶液、L-鼠李糖、D-葡萄糖进行分离。展程约8 cm，取出晾干，喷以苯胺-二苯胺-磷酸，喷后于105℃加热10 min显色。

2 结果与讨论

2.1 展开剂的选择

糖的薄层分析多用有机溶剂作展开剂，敖利[11]分别用正丁醇-丙酮-水和正丁醇-甲醇-丙酮-水分离了红参和麦冬，实验以传统有机溶剂正丁醇-丙酮-水(体积比为10∶10∶2.5)和正丁醇-甲醇-丙酮-水(体积比为10∶4∶8∶2.5)以及不同含水量的微乳液为展开剂，于室温上行法展开，在硅胶G-0.5%CMC-Na板上对D-果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、蔗糖进行分离，用苯胺-二苯胺-磷酸显色。

显色后，果糖为橙红色斑点，葡萄糖为浅蓝色斑点，蔗糖为褐色斑点，半乳糖为深绿色斑点，鼠李糖为浅绿色斑点。用含水量20%、30%、40%、50%的微乳液作展开剂时，各糖可以得到圆而集中的斑点，更大含水量的微乳液为展开剂时，斑点开始出现拖尾，含水量80%微乳液作展开剂时，薄层板上看不到斑点。正丁醇-丙酮-水(体积比为10∶10∶2.5)和正丁醇-甲醇-丙酮-水(体积比为10∶4∶8∶2.5)为展开剂时各斑点均有很大的拖尾。但无论以何种溶液作展开剂，若将实验用5种糖混合，在硅胶板上均不能很好地分开。从比移值来看，各糖比移值由大到小的顺序为：五碳糖(鼠李糖)、六碳酮糖(果糖)、六碳醛糖(葡糖糖、半乳糖)、二糖(蔗糖)；唯一例外的是以正丁醇-甲醇-丙酮-水作展开剂时，葡萄糖比移值显示略大于果糖。

以各微乳液含水比例为横坐标，以各糖比移值为纵坐标，绘制曲线，如图1所示。由图1可以看出含水量不同的各微乳液对各糖的分离效果。含水量在30%～60%之间时比移值有一定差异，但含水量60%时，斑点有拖尾现象，因此选择含水量40%微乳液作为微乳展开条件。

1—鼠李糖； 2—果糖； 3—葡萄糖； 4—半乳糖； 5—蔗糖

2.2 薄层板的选择

糖的薄层色谱分析已有不少文献报道，糖的极性较大，采用无机盐缓冲液调硅胶G板，使分离效果改善[11]。因此，以40%微乳液为展开剂，分别于硅胶G-0.5% CMC-Na板、硅胶G-0.5% CMC-Na-0.3 mol/L NaH2PO3板、硅胶G-0.5%CMC-Na-0.1 mol/L硼酸板上对D-果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、蔗糖进行分离，用苯胺-二苯胺-磷酸显色分离。从斑点效果上看，用硼酸溶液作薄层板比用硅胶G作薄层板分离的斑点集中。因此，选择硅胶G-0.5%CMC-Na-0.1 mol/L硼酸板进行样品分离。

2.3 糖样品的分离

芸香苷水解糖的传统分离法是纸色谱法，分离所得斑点较为分散，而且用纸色谱分离，对检测所用试剂有所限制。在2.1和2.2条件基础上，用40%微乳液作展开剂，在硅胶G-0.5%CMC-Na-0.1 mol/L硼酸板上进行了芸香苷水解糖的分离，分离结果满意，与传统分离方法[10]相比，微乳液作展开剂分离所得斑点更为集中，故而灵敏度更高。

3 结语

以十二烷基硫酸钠为表面活性剂，正丁醇为助表面活性剂，正庚烷为油相，水为水相的微乳液作展开剂对糖在硅胶板上进行了分离分析。与传统展开剂相比，含水20%～60%的微乳液作展开剂在硅胶板上分离糖，均可得到规则清晰、圆而集中、不扩散不拖尾的斑点，将该法用于槐米芸香苷水解糖样品的分离，得到理想的分离效果。

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