Livin基因表达与食管鳞癌化疗药物敏感性的相关性研究*

张 强 高 岩 王新立 穆玉恕 王宗福 高 松

(1. 泰山医学院附属医院，山东 泰安 271000；2. 泰安市中医医院，山东 泰安 271000)

食管癌(Esophageal carcinoma， EC)是消化系统常见恶性肿瘤之一。化疗作为全身性治疗手段在食管癌的治疗中具有不可替代的作用 。但由于在食管癌组织中存在多种耐药基因的扩增及临床经验用药等原因使化疗不可避免地存在盲目性及随意性，造成了食管癌化疗效果欠佳，继发性耐药及不必要的毒副作用。 因此，肿瘤化疗的敏感性研究已成为人们关注的焦点，以抗癌药物个体化治疗为目的的MTT药敏实验愈来愈受到重视。通过药敏实验，在化疗实施前筛选出有效的药物，对于实现肿瘤化疗的合理化、个体化用药有实用价值。

Livin是新近发现的凋亡抑制蛋白家族(inhibi torofapoptosisprotein,IAP)成员之一,是从人类基因组cDNA文库中克隆得到的一种蛋白质,同时也被命名为ml IAP、KIAP。研究表明Livin在正常成人组织中不表达或低表达,在多数肿瘤组织中高表达,如黑色素瘤、乳癌、宫颈癌、膀胱癌、白血病以及淋巴瘤等。新近研究表明Livin可能还与肿瘤的化疗药物的耐药性有关[1]，本实验着重研究原代食管癌细胞对化疗药物的敏感性，并进一步探讨其敏感性与食管癌组织中Livin基因表达的关系，为食管癌的临床化疗提供个体化用药的实验资料和依据。

1 材料与方法

1.1临床资料 收集泰山医学院附属医院2007年12月至2008年12月外科手术切除的80例食管癌标本。所有病例均经胃镜活检病理证实且术前未行化疗、放疗。其中男性52例，女性28例，年龄46岁-78岁，中位年龄56岁。

1.2材料 RPMI-1640完全培养液GIBCO公司产品，10%胎牛血清、MTT 美国Sigma公司产品，异丙醇 苏州正兴化工研究院产品。紫杉醇(taxol, Tax) 四川太极制药有限公司产品，顺铂(cisplatin，DDP)中国山东齐鲁制药厂产品，阿霉素(adriamycin ，ADM)中国山东新华制药厂产品，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)中国上海华联制药有限公司产品，丝裂霉素(fitomucin ，MMC)中国黄石美升药业有险公司产品。Livin兔抗人多克隆抗体，SP试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。

1.3取材

80例食管癌组织均来自泰山医学院附属医院外科手术切除标本。从瘤体生长活跃、无坏死变性的部位取材，用酸性离子水反复冲洗，外观半透明，呈新鲜鱼肉状，有质感和弹性。置于预先准备好的装有Hanks液的无菌冻存管中。

1.4肿瘤细胞悬液制备

在超净工作台上，食管癌组织用灭菌PBS冲洗3遍，无菌剪刀剪成糊状，200目铜网研磨过滤，过滤后以3000r/min离心10min，去掉上清后用Hanks液漂洗二次后，用台盼蓝染色记数活细胞数大于95%，用10%胎牛血清RPMI-1640培养液重悬，用血细胞计数板调整单细胞悬液至活细胞浓度 (2～3)×105 个/ml。

1.5MTT药物敏感试验

实验分为3组，(1)用药组：取分离纯化后的单细胞悬液加入96孔培养板，每孔180ul，分别加入药物终浓度为10倍血浆峰值浓度(见表1)的紫杉醇( Tax)、顺铂(DDP)、阿霉素(ADM)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、丝裂霉素(MMC)，每组药物设4个复孔；(2)对照组：每孔加入分离纯化后的单细胞悬液180ul，不加药物；(3)空白组：加180ul培养液，无培养细胞；置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养48小时后，加入5mg/m l的MTT10ul于各孔，继续培养4小时。加入0.04N盐酸异丙醇100ul/孔充分溶解所生成的甲瓚，静止10分钟，通过酶标仪在570nm波长检测光密度值(OD值)的变化。取4复孔OD值的平均值作为细胞在此药物组的平均OD值。肿瘤细胞抑制率=(对照组OD值-用药组平均OD值)/(对照孔平均OD值-空白组OD值)×100%。判断标准：肿瘤细胞抑制率>5O%为高度敏感，30～50%为中度敏感，<30%为不敏感,既为耐药。

1.6免疫组化实验

应用免疫组化SP法检测标本中livin蛋白的表达。严格按试剂盒说明书进行。对照设置：用已知PTEN阳性的结肠粘膜染色结果为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

结果判定：根据相关文献[2]制定，采用双盲法对每张切片在高倍镜(×400)下计数5个视野。以染色强度分别计为：0分为细胞核和/或细胞浆内无染色颗粒；1分为细胞核和/或细胞浆内有黄染的细小的颗粒；2分为细胞核和/或细胞浆内有较多的黄色颗粒；3分为细胞核和/或细胞浆内有粗大的棕黄色颗粒。再以染色阳性细胞比例分别计为：0分为无阳性细胞；1分为阳性细胞数为1～25%；2分为阳性细胞数为26～50%；3分为阳性细胞数为51～100%。最后免疫组化染色结果以两项相加得分 > 2分为阳性，0～2分为“-”，3～4分为“+”，4～5分为……

1.7统计学分析

所有实验数据采用SPSS12.0统计包进行分析，用χ2检验，连续性校正χ2检验和Fisher精确概率计算法进行计数资料的显著性检验。P< 0.05视为差异具有统计学意义.

2 结 果

2.1化疗药物作用后原代食管癌细胞的体外抑制率

MTT检测结果提示，不同个体食管癌细胞对化疗药物的敏感率各不相同；五组药物之间敏感性差异具有统计学意义(P<0.05)，其中TAX、MMC 及5-FU之间敏感性差异无统计学意义，P值均大于0.05；但TAX、MMC 及5-FU与ADM及DDP之间敏感性差异具有统计学意义(P<0.05),前者明显高于后者； ADM敏感性明显低于DDP，组间差异具有统计学意义(P<0.05)；对临床用药有指导作用(表1)。

表1 食管癌组织MTT药敏检测结果(例，%)

注：H=14.92,P=0.005，组间差异具有统计学意义。

﹡与ADM组相比，q值=3.64，P<0.05; ﹡与DDP组相比，q值=4.56，P<0.01; ﹡﹡与ADM组相比，q值=4.39，P<0.01; △与ADM组相比，q值=3.65，P<0.01; △与5-FU组相比，q值=5.36，P<0.01; #与ADM组相比，q值=3.77，P<0.05; #与DDP组相比，q值=4.48，P<0.05;

2.2食管癌组织中Livin的表达与化疗药物体外抑制率的关系

将MTT检测结果中抑制率≥30%者判为敏感，而<30%者判为耐药。Livin阳性表达与5-FU及DDP的体外耐药性有统计学意义(P=0.010、P=0.031)，P值均小于0.05；而与TAX、ADM及MMC的体外耐药性无关(P>0.05)。(表2)

表2 食管癌组织中Livin表达结果与MTT药敏的关系

图1 原代胃癌细胞化疗药物作用后胞浆、胞核固缩，胞内出现空泡 ×200

图2 食管鳞癌中Livin胞核，胞浆阳性表达 ×200

3 讨 论

食管癌是我国常见恶性肿瘤之一。其五年生存率仍在20%以下，严重威胁着我国高发区人民的生命。化疗作为全身性治疗手段在食管癌的治疗中具有不可替代的作用，尤其对已处于转移和播散期的食管癌患者，有效化疗是延长生存期必不可少的方法。但由于肿瘤细胞生物学特性的差异以及对化疗药物产生耐药等原因，造成了食管癌化疗效果欠佳。

Livin 是凋亡蛋白抑制子 (inhibitor of apoptosis protein,IAP) 家族的重要成员，Livin的结构比较特殊， 它由 α和 β亚基组成， 这两个亚基各有一个(baculovirus inhibitory repeat,BIR) 序列， 完整的 Livin结构是一种能抑制细胞凋亡的细胞内蛋白质， 它能与半胱氨酸- 天冬氨酸蛋白酶 (Caspase)-3,7,9 结合， 抑制 Caspase 活性， 阻断死亡信号的转导。由于 Livin 能抑制Caspase 的活性， 因而肿瘤细胞内过表达的 Livin 在肿瘤细胞耐受药物诱导凋亡过程中起着关键性作用。[3]

刘凌翔等研究发现， DDP 作用于 BGC-283， 早期表现为 Livin 表达的抑制， 但随着时间的延长， Livin 表达出现明显上调[1]。可能其早期通过下调局灶连接 FAK 蛋白和 ECM整合蛋白介导的抗凋亡途径， 来抑制IAPS的表达[4]，而在 DDP 作用的晚期， 随着 NF-κB 表达的逐渐增强， 最终又使 IAPS 上调， 抑制了凋亡,使细胞产生耐药[5]]。这与既往研究中多数细胞毒性药物(紫杉醇、顺铂和阿霉素等) 使 Survivin 上调[6]的结论一致.本研究结果表明Livin阳性表达者与DDP耐药有关(P<0.05)，与上述研究结果一致,本研究还发现Livin阳性表达者与5-FU耐药有关(P<0.05),提示Livin可作为食管癌原发性耐药标志之一。本研究还发现食管癌对不同的化疗药物敏感性差异很大，以MMC、TAX及5-FU好，而传统的、经验的抗癌药物ADM及DDP的高度敏感率分别只有33.7%,27.5%，实验结果对食管癌的临床化疗用药有指导作用。

总之,Livin 在肿瘤细胞抗凋亡诱导和保护肿瘤细胞免受化学药物毒性作用的机制， 还是一个未阐明的科学问题。 但是由于肿瘤细胞内Livin 的过表达， 导致了肿瘤细胞对 TRAIL、化学药物耐受， 这些是临床上采用细胞因子和化学药物治疗肿瘤时要面临的肿瘤耐药问题。所以应该把 Livin当成新的靶标， 通过靶向性抑制 Livin 表达， 解除Livin 对 Caspase 的抑制， 使凋亡信号通路通畅， 从而增加癌细胞对化学药物的敏感， 这些研究将开辟一条新的安全有效治疗肿瘤的途径。

[1] 刘凌翔， 朱华云，张锦英，等；两种铂类药物对人胃癌细胞 Livin 基因表达的影响[J].南京医科大学学报( 自然科学版),2007：27(5)415-418.

[2] 王晨, 卫建平, 张晓琴等. 五种乳腺癌预后相关指标在乳腺肿瘤中的表达及其临床意义[J]. 中国药物与临床,2005,5(8):602-606.

[3] 李孟森 周 升 李 刚等;Livin 基因过表达与肿瘤耐药的研究进展[J].中国药物与临床, 2006,6(2)85-87.

[4] Andjilani M,Droz JP,Benahmed M,et al.Down-regulation of FAK and LAPs by laminin during cisplatin-induced apoptosis in testicular germcell tumors[J],2006,28(2):535-542.

[5] Malinge S, Monni R,Bernard O,et al.activation of the NF-kappaB pathway by the leukemogenic TEL-jak2 and TEL-AB1 fusion proteins leads to the accumulation of antiapoptotic IAP proteins and involves IKK alpha [J], oncogene, 2006,25(25):3589-3597.

[6] Ling x, bernacki RJ, Brattain MG, et al, induction of urvivn expression by taxol(paclitaxel)is anearly vent,which is independment of taxol mediated G2/M RREST[J],J Biol Chem, 2004;279(15):15196-15203.