壳聚糖用于五苓滴丸澄清工艺的考察

金 岩,张 宇,李三鸣

五苓滴丸是本实验室拟研制的新剂型,其组方基础是“五苓散”。“五苓散”系汉代著名医家张仲景所创的名方成药之一,见于《伤寒论》,是利水渗湿的代表方。其组成为泽泻、茯苓、猪苓、白术、桂枝共 5味药物。其功用为通阳化水、健脾利水,对泌尿系统、呼吸系统、内分泌系统、循环系统、消化系统、神经系统、代谢疾病、运动骨骼系统疾病均有一定的治疗作用[1]。五苓水煎剂的澄清工艺未见报道。本文利用壳聚糖絮凝剂,对五苓水煎液进行澄清,选择干浸膏收率、总多糖含量为指标进行考察,并与醇沉法比较,筛选出最佳澄清工艺条件,为制备五苓滴丸新剂型提供可靠的依据。

1 仪器与试药

赛多利斯电子天平 CPA225D(赛多利斯科学仪器北京有限公司),TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。泽泻、茯苓、猪苓、白术、桂枝(均购自辽宁正大医药有限公司),壳聚糖(脱乙酰度 90%,浙江金壳生物化学有限公司),葡萄糖对照品 (中国药品生物制品检定所),蒽酮(天津市科密欧化学试剂开发中心),乙腈、甲醇为色谱纯,水为重蒸水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 五苓滴丸的处方 泽泻 150g,茯苓 90g,猪苓 90g,白术 90g,桂枝 60g。

2.2 制备工艺 称取泽泻 150g,乙醇提取后取药渣挥干乙醇备用;按处方量分别称取茯苓、猪苓、白术、桂枝 4味药,与泽泻药渣合并,用 6倍量的水提取 3次,每次 1.0h,旋转蒸发至药材与药液比为 1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1共 5个浓度药液备用。

2.3 干浸膏收率的测定 精密移取提取液 5mL,置干燥至恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,于 105℃干燥至恒重,移置干燥器中,放置 30m in,迅速称定重量,并计算干浸膏收率(W/W)。

注:E为干浸膏收率,Wd和Wt分别表示干浸膏量和总药材量

2.4 葡萄糖含量的测定

2.4.1 蒽酮硫酸试液的配制 称取蒽酮 0.200 4 g,置于锥形瓶中,加入浓硫酸 100mL,使溶解,即得。临用新配。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取葡萄糖对照品 0.052 0g,置于 100mL容量瓶中,加蒸馏水溶解,并稀释至刻度,摇匀,得 520.0μg/mL的葡萄糖对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 取五苓水煎液适量, 5 000r/m in离心 10m in,精密移取上清液 1mL,加水稀释定容至一定体积,摇匀,得供试品溶液。2.4.4 葡萄糖标准曲线的绘制 分别精密吸取葡萄糖对照品溶液 0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mL于 10mL具塞试管中,用水补充到 1mL,置冰水浴中,分别迅速加入新配制的蒽酮硫酸试液4mL,各管加完后一起浸入沸水浴中煮沸 10m in,自来水迅速冷却并放至室温。以空白溶液为对照,在625nm波长处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度(C)为横坐标、吸光度 (A)为纵坐标进行线性回归,得标准曲线:A=6.101 7C +0.065 8,r= 0.999 0。结果表明,葡萄糖在 10.4～104.0μg/ mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.4.5 测定方法 精密吸取对照品溶液、供试品溶液各 1mL于具塞试管中,置冰水浴中,迅速加入新配制的蒽酮硫酸试液 4mL,按照“2.4.4”项下方法测定。

2.5 壳聚糖澄清工艺的考察 壳聚糖絮凝工艺的优化:本试验采用天然絮凝剂对药液进行精制,以总多糖含量和干浸膏收率为指标,对五苓散提取液精制方法进行考察。

2.5.1 絮凝剂溶液的制备 壳聚糖溶液的配制:取壳聚糖适量,加 1%醋酸制成 1%(w/v)的溶液。

2.5.2 单因素考察 ①絮凝温度:取6支试管,各加入 30mL药材提取液(1∶2),加入壳聚糖溶液各3mL,摇匀,分别在室温及 30、40、50、60、70℃下保持恒温 30m in,于 4℃冰箱中静置过夜,观察澄明效果。结果显示,壳聚糖溶液于 40℃对提取液的絮凝效果最好。②搅拌强度:取 4个烧杯,各加入 30mL药材提取液(1∶2),加入壳聚糖溶液各 3 mL,40℃下分别置于 0、50、100、150r/m in磁力搅拌器中,搅拌 10m in,于 4℃冰箱中静置过夜,观察其絮凝效果。结果显示,壳聚糖溶液于 50r/m in时,对提取液絮凝效果最好。③搅拌时间:取 4个烧杯,各加入 30mL药材提取液 (1∶2),加入壳聚糖絮凝剂,条件如前述优化结果,分别搅拌 0、5、10、15m in,于 4℃冰箱中静置过夜,观察其絮凝效果。结果显示,搅拌 10m in对提取液絮凝效果最好。④絮凝药液浓度的选择:5个浓度的药材浓缩液各取 30mL,按表 1加入 1%的壳聚糖溶液,40℃下,以50r/m in搅拌 10m in,于 4℃冰箱中静置过夜,观察其絮凝效果。见表 1。

实验表明,壳聚糖澄清剂在药液中的加入量与药液所含的药材量有关,且随着药液的密度增加,需加入的壳聚糖量有增大的趋势。药液经过壳聚糖絮凝后,絮体状态会影响生产效率。絮体呈松絮状,沉淀易于过滤;絮体呈紧絮状,则过滤难,势必增加生产周期。所以选择松絮状的絮体。

表1 不同药液浓度的澄清试验结果

当药材与药液浓缩比为 1∶4时,絮体为松絮状,上层液的澄清度较好。当絮凝温度、药液浓缩比例、搅拌时间和强度固定后,絮凝剂的加入量则成为影响澄清度的最主要因素。

⑤絮凝剂用量的考察:由表 1可见,当药材与药液浓缩比为1∶4,壳聚糖加入量为3～9 mL,此时絮凝效果好,上层液体澄清。取 11个烧杯各加入50 mL药材提取液 (1∶4),按表 2加入不同体积的1%壳聚糖絮凝液。40℃下,以 50 r/min搅拌 10 min,处理后转移至 50 mL比色管中,于 4℃冰箱中静置过夜,观察其絮凝效果。取上层液分别测总多糖含量和干浸膏收率,结果见表 2。

表2 壳聚糖絮凝结果

由表 2可见,壳聚糖用量对澄清效果影响较大,随着絮凝剂加入量增大,药液由浑浊变澄清,当壳聚糖的量超过一定值时,药液又从澄清状态逐渐变为浑浊,同时,药液中有效成分含量也随之降低,干浸膏收率下降。从上层液澄清度来看,加入量从 8～13 mL都在澄清范围内,其中 6号加入量为 10 mL时,总多糖含量最高。而从干浸膏收率来看,4号加入量为 8 mL时最高,但其总多糖含量较低。比较两者的收率相差不大,故综合考虑,壳聚糖絮凝剂的加入量为 10 mL为宜,即每 100 mL药液,壳聚糖的用量为0.2 g,100 g药材加入壳聚糖 0.8 g。

2.6 壳聚糖絮凝法与醇沉法工艺比较 取药材提取液(1∶4)共 2份,1份按照壳聚糖最佳澄清工艺精制药液;另 1份缓缓加入 95%乙醇,边加边快速搅拌,使药液最终含醇量达到 80%。将 2份药液于 4℃冰箱中静置过夜。分别取药材原提取液(1∶4)、壳聚糖絮凝法和醇沉法精制后的药液,测定总多糖含量及干浸膏收率。见表 3。

表3 壳聚糖絮凝法与醇沉法的比较

由表 3可知,2种澄清方法处理后的药液上层液都很澄清,干浸膏收率相差不多。与药材原提取液相比,2种澄清方法对干浸膏收率有显著性影响。在除去杂质的同时,活性成分总多糖的保留率上,壳聚糖絮凝法明显优于乙醇沉淀法。所以,选择壳聚糖絮凝法作为药材提取液的最终精制方法,药材与药液的浓缩比例为 1∶4,壳聚糖最佳用量为 0.8%(g/g),于 40℃下,以50 r/min的速度,搅拌 10 min,静置过夜,滤过,即得。

3 讨论

3.1 壳聚糖是一种天然吸附澄清剂,是仅次于纤维素的第二大多糖,属天然阳离子絮凝剂,无毒无味,可生物降解,不会造成二次污染。其分子结构与纤维素相似,当溶解于稀酸溶液中时,可与药液中带负电荷的纤维素单宁、粘液质等杂质以及带负电荷的细菌结合,形成沉淀而被除去,达到澄清的目的。壳聚糖是甲壳素 (Chitin)的部分脱乙酰产物,来源极其丰富,广泛存在于蟹、虾等低等动物以及藻类、真菌等植物中,随着我国水产养殖业的不断发展,沿海地区海产品加工厂废弃的虾蟹等的数量巨大,所以壳聚糖的成本非常低,并且应用方便,长期口服无明显毒副作用,使用安全[2]。

3.2 实验中发现,药液密度高,导致壳聚糖加入量增加,成本增加。壳聚糖加入量过低达不到澄清效果,过高会使絮凝恶化,药液又由澄清状态重回混浊状态,所以,严格掌握壳聚糖的加入量,才能达到理想的澄清效果。实验中壳聚糖絮凝剂和蒽酮硫酸试液都要临用新配。

3.3 衡量药液澄清效果的重要标志是药液中有效成分的保留率高、澄清速度快、生产周期短。五苓滴丸中 4味药皆含有多糖,后者是重要的药理活性成分[3]。壳聚糖絮凝法对药液中的多糖保留率高,与文献[4]报道一致。而传统的醇沉除杂法澄清时间较长。据报道,醇沉法造成了有效成分的大量流失,尤其是对免疫有重要调节作用的多糖易被除去[5]。工业生产中还存在乙醇回收等问题,导致生产周期长,成本较高,不利于节约能源。本文采用壳聚糖澄清技术,工艺简单,成本低,生产周期短,絮凝速度快,稳定性好[6]。壳聚糖絮凝法可代替醇沉法用于澄清五苓滴丸水煎液。

3.4 蒽酮硫酸法的反应原理是糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物,可与蒽酮试剂缩合产生有色物质,反应后溶液呈蓝绿色,于 625 nm处有最大吸收,显色与多糖含量成线性关系。将样品溶液稀释到蒽酮-硫酸法测糖的标准曲线范围内,可方便、快速、准确地测出样品中的多糖含量。

[1] 郑慧敏,郑梅.五苓散的实验研究和临床应用的新进展[J].江西中医药,2007,38(4):70-71.

[2] 石铃,胡利平,浦锦宝,等.壳聚糖的安全性研究[J].中国海洋药物,2000,19(1):25-28.

[3] 刁波,唐瑛,王晓琨.中药多糖研究新进展[J].中国医药导报,2008,5(3):21-22.

[4] 张彤,徐莲英,李海燕,等.壳聚糖用于大青叶等中药浸提液澄清效果的研究[J].中成药,1998,20(10):7-10.

[5] 彭平建.水醇法应用的若干问题[J].基层中药杂志,1998,12 (4):46-48.

[6] 梁宇红.黄芪口服液制备工艺的优选[J].实用药物与临床, 2008,11(6):386-387.