COX-2、Ang-2在胃癌中的表达及其与淋巴管生成间的关系*

刘振忠 冯善龙 杨 柳 孔 伟 王新立 王庆宝

(泰山医学院附属医院，山东 泰安 271000)

淋巴转移是恶性肿瘤独有的恶性行为学特征，是影响恶性肿瘤进展的重要因素。近年来，随着淋巴管特异性标记物D2-40、VEGFR-C、Podoplanin、 LYVE-1等陆续被发现，使淋巴内皮细胞和血管内皮细胞得以区别开来，对研究肿瘤淋巴管转移起到了极大的促进作用。环氧合酶(cyclooxygenase COX)是花生四烯酸代谢的关键性限速酶，是一种膜结合蛋白，具有环氧合酶和过氧化物合成酶双重酶的功能。研究发现Ang-2 可使肠系膜淋巴管内皮细胞的Tie2 受体磷酸化, 促进淋巴管内皮细胞迁移，增殖作用[1]。两者作为重要的淋巴管生长因子，在淋巴管生成过程中均具有重要作用。本研究就Ang2和COX-2 在胃癌中的表达关系及其意义进行探讨。

1 材料与方法

1.1 临床资料

48例胃癌标本为泰山医学院普外科2007年7月～2009年7月间行胃癌根治术的切除标本，术后病理结果均为腺癌。所有病例术前均未化疗、放疗或激素治疗。其中包括男40例，女8例，中位年龄57岁；TI期5例，T2期12例，T3期27例，T4期4例；有淋巴结转移者36例，无淋巴结转移者12例。

1.2 免疫组织化学染色

用免疫组织化学SP法，鼠抗人D2-40单克隆抗体，免疫组化单染试剂盒均购自北京中杉生物工程有限公司。将标本制成层厚为4um连续切片，经常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，水化，高压修复，3%过氧化氢溶液，滴加山羊血清封闭后，滴加一抗(D2-40工作液，浓)，4 ℃过夜，PBS冲洗，滴加生物素标记的二抗，甩去PBS液，滴加链霉菌抗生物素一过氧化物酶溶液，加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～5分钟，苏木素复染30秒，温热PBS冲洗返蓝，经梯度酒精脱水干燥二甲苯透明，中性树胶封片。每批标本染色过程中均设置阳性对照和阴性对照。淋巴管密度计数采用Wendner等[2]的方法，计数标准：先在低倍镜(×40)下全面观察切片，确定淋巴管密度最高处，即热点。再在高倍镜下(×200)计数D2-40阳性的淋巴管数目。应用多功能病理图像分析仪计数每一份标本5个视野内的淋巴管个数，合计5个视野内淋巴管均数作为该部位的MLVD。

1.3 RT-PCR

选取基因保守序列，应用Primer5软件，设计目的基因COX-2、Ang-2以及内参基因β-actin引物，由上海英潍捷基生物工程技术有限公司合成。引物具体序列：COX-2上游引物TCG CCC TCC CAT CCC TAC GC，下游引物AGA GGG GGT AGA GGG GGT GCT (477bp)； Ang-2上游引物CGC CGC TCG AAT ACG ATG A，下游引物CGT CTG GTT CTG TAC TGC ATT(158bp)；β-actin上游引物CTG GAA CGG TGA AGG TGA CA，下游引物AAG GGA CTT CCT GTA ACA ATG CA(148bp)。按试剂盒说明提取总RNA并逆转录成cDNA，PCR反应程序：94 ℃预变性5分钟；94 ℃变性30秒，退火温度退火30秒， 72 ℃延伸45秒，共40个循环；72 ℃延伸10分钟。2%琼脂糖凝胶电泳后，在成像分析系统上统计基因表达情况。

1.4 统计学分析

所有数据均采用SPSS 17.0统计软件包进行统计分析。计量资料结果以均数士标准差(Mean±Sd)表示，t检验；计数资料结果用χ2检验。P<0.05定为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 COX-2、Ang-2在胃癌中的表达。

本实验数据表明：39例COX-2mRNA高表达胃癌中有25例Ang-2mRNA阳性表达，14例阴性表达；9例COX-2mRNA阴性表达胃癌标本中有3例Ang-2mRNA阳性表达，6例阴性表达。在胃癌组织中COX-2与Ang-2的表达明显具有相关性。

2.2 胃癌中COX-2，Ang-2的表达与临床病理参数之间关系。

COX-2表达与胃癌TNM临床病理和有无淋巴结转移明显相关，Ⅲ+IV期病例的COX-2表达率显著高于I+Ⅱ期病例。与病人的年龄，肿瘤部位，肿瘤大小无关。Ang-2表达与胃癌TNM临床病理TNM分期和有无淋巴结转移相关，与其他临床病理资料无明显相关。不同临床病理生物学指标的胃癌COX-2、Ang-2表达情况见表1。

2.3 COX-2，Ang-2的表达与MLVD之间的关系

COX-2阳性表达组淋巴管密度平均为14.18±2.23个，高于阴性表达组淋巴管密度12.49±1.23个，MLVD在COX-2阳性表达胃癌标本中的表达率高于COX-2阴性表达的胃癌标本(t=2.189，P<0.05)。Ang-2阳性表达组淋巴管密度平均为14.76±1.98个，高于阴性表达组淋巴管密度12.60±1.83个。MLVD在Ang-2mRNA阳性表达胃癌标本中的表达率高于Ang-2阴性表达组的胃癌标本(t=3.882，P<0.05)，两者具有统计学意义。

表1 胃癌组织中COX-2、Ang-2表达与临床病理参数之间关系

表2 胃癌组织中COX-2，Ang-2的表达与MLVD之间的关系

图1 D2-40在胃癌癌旁组织中的表达(×200)

图2 COX-2在胃癌组织的表达电泳图

图3 Ang-2在胃癌组织的表达电泳图

3 讨 论

环氧合酶是花生四烯酸(AA)合成前列腺素(PGs)过程中一个重要的限速酶，作为一个重要的生化调节因子及多效酶，其具有抑制细胞凋亡、促进血管形成、增强细胞活动性等多种功能，参与体内包括炎症反应和肿瘤发生发展等在内的多个生理病理过程，参与了胃癌的形成、进展、转移等多种过程。COX-2的高表达与胃癌血管生成和淋巴管生成密切相关。目前发现COX-2可上调VEGF-C等基因[3、4]，但这不能充分解释COX-2促进肿瘤淋巴管生成的机制，因此推测可能还有其他一些基因起作用。

血管生成素(Angiopoietins, Ang)是一族分泌型的细胞因子，因为能促进血管生成，故被命名为血管生成素。Ang-2可竞争性拮抗Ang-1的作用，其通过竞争性抑制Ang-1与受体酪氨酸激酶Tie2 的相互作用参与血管重塑和血管内膜去稳定的过程[5]，遗传学表明，Ang2也是在淋巴管发育过程中起关键作用[6]，研究还发现Ang1 和Ang2 均可使牛肠系膜淋巴管内皮细胞的Tie2 受体磷酸化，从而诱导淋巴管内皮细胞增殖和迁移[1]。

以往对COX-2、 Ang-2的研究主要在促进肿瘤血管生成方面，两者在肿瘤淋巴管生成方面有无协同作用研究较少，两者的表达与胃癌淋巴管生成间有无关系尚未见文献报道。本研究结果表明，COX-2、 Ang-2在胃癌中均高表达，且两者之间具有正相关关系。这与国外研究相一致[7]。结合临床病理资料，我们发现COX-2、 Ang-2的表达均与胃癌的淋巴结转移，TNM临床分期有关，提示COX-2可影响Ang-2在胃癌中的表达，特别在缺氧状态下，刺激细胞中Ang-2水平升高，从而共同影响胃癌的生物学行为，COX-2抑制剂影响胃癌细胞Ang-2的表达从侧面也证实了COX-2上调Ang-2在胃癌中的表达[8]。

我们通过检测48例胃癌组织中COX-2、Ang-2的表达及癌旁组织淋巴管密度，评估淋巴管密度与COX-2、Ang-2相互关系，发现COX-2表达阳性组淋巴管密度高于COX-2表达阴性组，Ang-2阳性组淋巴管密度明显高于Ang-2阴性组。MLVD作为反映胃癌微淋巴管生成状况的指标，提示COX-2、 Ang-2的表达在促进肿瘤周围淋巴管新生过程中起重要作用。

作为重要的促淋巴管生成因子， COX-2与Ang-2诱导肿瘤组织淋巴管新生的确切机制仍需进一步研究。如果能彻底阐明两者在胃癌肿瘤淋巴管新生过程中的具体作用机制，将对胃癌抗肿瘤淋巴管转移的临床治疗产生深远影响。

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