豚鼠耳蜗基底膜硝酸银染色铺片法的改良与观察

2010-01-25蔡琴芳蒋立新

听力学及言语疾病杂志 2010年3期

蔡琴芳蒋立新

耳蜗基底膜硝酸银染色铺片法是耳科学基础研究和内耳疾病研究应用较广泛的的一种方法，其特点是染色后毛细胞及其表面纤毛显示清晰且易于观察和计数等[1]。但该方法在铺片过程中存在一些难点和不稳定因素，如硝酸银染色不均匀，基底膜剥离不完整等。本研究在常规耳蜗基底膜硝酸银染色铺片法的基础上提出一些改进，取得了比较满意的观察效果，现报告如下。

1 材料与方法

1.1实验试剂与材料试剂：0.5%硝酸银、蒸馏水和10%甲醛。材料：止血钳、眼科剪、小尖镊、小剥离子、1毫升注射器、玻璃皿、离心管、解剖显微镜和电子显微镜。

1.2实验动物选择体重250～300 g、耳廓反射灵敏的健康白色红目豚鼠20只，随机分为对照组10只，用常规方法行基底膜硝酸银染色，改良组10只，用改良法行基底膜硝酸银染色。

1.3基底膜硝酸银染色铺片

1.3.1取材每组动物迅速断头后即刻经颅骨背侧快速取出双侧听泡。

1.3.2灌注染色小号止血钳咬开听泡，暴露耳蜗，修剪掉耳蜗周围多余的的骨壁，在解剖显微镜下放大10倍，用1毫升注射器针头在蜗尖处挑开小孔，挑开圆窗膜，去除镫骨，使耳蜗的前庭阶和鼓阶开放后，抽取0.5%硝酸银溶液，经蜗顶小孔缓慢灌注，每只耳蜗约灌注2～3 ml，然后抽取蒸馏水同法灌注以冲洗耳蜗，一般2次即可。

1.3.3固定还原用1毫升注射器抽取10% 中性福尔马林固定液同法灌注耳蜗3 次，再放入10% 中性福尔马林固定液，将标本保留在 4℃冰箱内继续固定还原4小时。

1.3.4曝光显色对照组固定后的耳蜗标本置放于100 W的白炽灯下，距离光源10 cm，曝光1小时[2]。改良组则先去掉蜗壳，取出蜗轴，置于10%福尔马林溶液中直接曝光。具体操作方法如下：将固定还原后的耳蜗标本移入盛有蒸馏水的玻璃皿中，在解剖显微镜下放大10倍，用小尖镊从开放的圆窗进入鼓阶，沿鼓阶走向撬开基底回的蜗壳，然后顺势向上以“脱帽”方式,将蜗壳连同螺旋韧带轻轻取下，保留完整的基底膜附着于蜗轴的骨螺旋板边缘[3]。用小剥离子于底回的下方将蜗轴切断后，小尖镊细心夹起并放入盛有10% 中性福尔马林固定液的透明离心管中，置放于100 W的白炽灯下，距离光源10 cm，10分钟左右后标本即可变为棕褐色，然后进行下一环节实验。

1.3.5基底膜剥离对照组因耳蜗尚藏于蜗壳内，首先使用铲刀把耳蜗底部骨壁铲磨平整，使耳蜗呈直立状态。将靠近颞骨岩部一侧的厚骨壁铲薄，铲至隐约可见深褐色的螺旋韧带时为止。用分离针小心地将蜗壳骨壁轻挑下来，由蜗尖向蜗底逐步分离，然后用尖细的油丝镊子轻轻地撕下螺旋韧带、前庭膜及盖膜，最后从蜗尖向蜗底逐步地把盘绕在宝塔形耳蜗轴外缘上的基底膜小心取下[4]。改良组标本在曝光程序中已经去除了蜗壳及螺旋韧带，保留完整的基底膜附着于蜗轴的骨螺旋板边缘。将棕褐色蜗轴转入盛有蒸馏水的玻璃皿内后，用尖镊固定蜗轴，以1毫升注射器针头从底回向顶回逐步剥离，即可快速取下完整的基底膜，用针头和小尖镊轻轻地分离并撕下前庭膜与盖膜。

1.3.6铺片小剥离子将耳蜗基底膜按螺旋转数切成四段后一一移放到清洁载玻片上，用滤纸吸干，在上面点一滴纯甘油。然后在解剖显微镜下检查、调整标本，保证正面朝上，铺放平整，放上盖玻片，周围用中性树胶封固，在高倍显微镜下观察并摄片。

2 结果

两组动物耳蜗基底膜均完整剥离，对照组曝光需1小时，改良组曝光仅需10分钟且操作更加简便，平均每个标本的铺片过程耗时较对照组约少一个小时。对照组可清晰地显示内外毛细胞及其表面纤毛簇(图1)，改良组亦可清晰显示内外毛细胞及其表面纤毛簇，可见三排外毛细胞和一排内毛细胞，排列整齐，外毛细胞表面听纤毛呈现V字形，内毛细胞表面听纤毛呈现弓字形(图2)。

3 讨论

耳蜗基底膜硝酸银染色铺片法可直接观察毛细胞的形态学变化，目前较常用的耳蜗基底膜硝酸银染色铺片法[5],主要步骤是取材、灌注染色、固定还原、曝光显色、剥离与铺片，本实验主要在曝光显色及基底膜剥离方法上进行了改进。在常规基底膜硝酸银染色铺片技术中，染色过程中基底膜藏于蜗壳内，容易造成曝光不够，染色不均等，因此，有人强调要在日光直射下或者置于100 W的白炽灯下曝光1小时[2]。本实验改良组选择先去掉蜗壳，经硝酸银灌流浸润的基底膜可直接暴露在光线下，染色直观，显色亦更加均匀稳定。因为直接曝光染色法不需要强烈的光线，如果条件不允许，可不需特意准备光源，自然曝光至标本变为棕褐色即可，实验更加简便可行。常规基底膜硝酸银染色铺片技术，因蜗轴尚附着于耳蜗底部骨壁，基底膜的剥离一般是由蜗尖向蜗底依次进行[4]，而在本实验中，蜗轴已完全从耳蜗先分离出来，采用逆向剥离法——从底回向顶回逐步连续剥离，可快速、顺利、完整地取下基底膜。文中结果显示，改良法耳蜗基底膜剥离完整，毛细胞和听纤毛显色清晰，但所需时间较对照组少，说明改良硝酸银染色铺片法操作简便，易于掌握，铺片效果满意，值得推广使用。