黄芩的花粉母细胞减数分裂及核型分析

程志号,蔡明历,郝大翠,邓瑞宁,刘 焰

(华中农业大学 药用植物研究所,湖北武汉 430070)

黄芩 (Scutellaria baicalensisGeorgi)为唇形科黄芩属多年生草本植物,以其根入药,是我国常用大宗中药材之一,应用历史悠久,历代本草均有记载.黄芩具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效[1],可用于治疗发热烦渴、肺热咳嗽、泻痢热淋、湿热黄疸、胎动不安、痈肿疮毒等症,最近研究发现黄芩还具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、抗癌、调节免疫力和抑制艾滋病毒 H IV-RT的作用[2]。从本草考证来看,历代用的黄芩至少有 4种原植物,而 2005年版《中国药典》中收载 Scutellaria baicalensis Georgi为正品药用黄芩。除黄芩外在我国尚有同属 6种植物在不同地区以黄芩入药,即粘毛黄芩 (S.viscidula Uge),甘肃黄芩 (S.rehderianaDiels.),滇黄芩 (S.emoenaC.H.Wright),川黄芩 (S.hypericifoliaLevl),丽江黄芩 (S.likiungensis Diels),大黄芩 (S.tenaxW.W.Smith var.patentipilosa[3]。这些黄芩属植物都与黄芩有类似的药效而在地方上作为正品黄芩的代用品,但其药效和黄芩苷的含量都不如正品黄芩,因此,它们没得到广泛的应用[4]。中药的传统鉴定方法因其简便直观等优点,在药用植物和中药材的鉴别上有着广泛的应用,但准确性较低。染色体作为植物遗传物质的载体,其数目和形态是植物体内比较稳定的重要特征,把染色体分类学的方法和技术应用于药用植物研究,可为药用植物的鉴定提供比较可靠的客观指标。本研究通过对黄芩花粉母细胞减数分裂过程中染色体的行为、成熟花粉粒的育性进行观察以及对其体细胞染色体进行核型分析,旨在为黄芩的良种选育、真伪品的鉴别、种质资源遗传多样性研究及种质资源分类提供细胞学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料是 2000年从河南省禹州引种,现种植于华中农业大学标本园内。

1.2 制片方法

1.2.1 减数分裂观察方法

取黄芩的幼小花蕾,用卡诺氏固定液 4℃下固定 24 h后,从花蕾中剥取花药,用 1 mol/L盐酸60℃恒温解离 5～6 min,用改良卡宝品红染色压片,在显微镜下观察摄影[5]。

1.2.2 花粉粒育性鉴定方法

取成熟的黄芩花粉粒于载玻片上,用 1%醋酸洋红染色 3 min后,在光学显微镜下观察、计数,并照相。染色深,外形圆的计为可育花粉粒,不染色或染色浅的,外形皱瘪的计为败育花粉粒。一朵花至少统计 300个花粉粒,计算可育花粉粒百分率。

1.2.3 体细胞观察方法

取黄芩种子置于 25℃培养箱中发芽,待根长到0.5～1.0 cm时,切取根尖置 0.002 mol/L 8-羟基喹啉中,在室温下预处理 2.5 h后,用卡诺氏固定液4℃下固定 24 h,再用 1 mol/L盐酸 60℃恒温解离10 min,蒸馏水洗净后切取根尖分生组织,用卡宝品红染色压片,在显微镜下观察摄影。

1.2.4 核型分析方法

取 50个分散良好,着丝点清晰的中期分裂相进行染色体计数,并从中选择染色体数目完整、无重叠的 5个分散较好的分裂相进行显微摄影。染色体相对长度、臂比及核型按 Levan(1964)[6]命名系统,染色体相对长度系数按 Kuo(1972)[7]方法划分,核型分类用 Stebbins(1971)[8]的标准。

2 结果与分析

2.1 花粉母细胞减数分裂过程观察结果

黄芩的绝大多数花粉母细胞减数分裂过程中染色体的行为正常,在前期 I的粗线期,一部分染色体上出现明显的染色深的染色粒 (图1-a)。终变期同源染色体配对后,可形成 9个高度浓缩、形态清晰的二价体 (图1-b),佐证了黄芩的染色体数目为2n=2X=18,该时期是染色体计数的最佳时期。在中期 I,可观察到 9个二价体排列到赤道面上形成赤道板,该时期也是染色体计数的好时期 (图1-c),少数细胞有染色体落后的现象。后期 I,配对的同源染色体彼此分离,分别走向细胞的一极,此时,在细胞两极可见各有 9条染色体,该时期也是染色体计数的好时期 (图1-d～e),此期观察到少数细胞中出现染色体桥现象 (图1-f)。在末期 I,染色体没有出现明显的解聚现象,在细胞两极分别形成两个新的子核,但细胞质不分裂 (图1-g)。前期 II,可见细胞两极各有 9个“x”状的染色体分散在细胞质中 (图1-h)。中期 II,2个子细胞中的染色体都排列到细胞的赤道面上,分别形成两个相互平行或垂直的赤道板 (图1-i～j),此期还观察到少数细胞中出现落后的染色体 (图1-k～l)。后期 II,每条染色体上的两个姐妹染色单体分开,分别走向细胞一极,2个子核的分裂方向相互平行或相互垂直,此时在细胞内可看到四组染色体 (图1-m～o),此期观察到少数细胞中出现落后染色体 (图1-p)。末期 II,在细胞内形成了 4个子核 (图1-q),最后细胞质分裂,同时形成 4个子细胞,即四分体 (图1-r);末期Ⅱ可见少数细胞分裂不同步,四分体时期有少数形成三分体。说明黄芩的减数分裂方式属于同时型。

在观察统计的 225个中期Ⅰ细胞中,有 6个细胞出现染色体落后的现象,异常频率为 2.67%;在254个后期 I细胞中,有 17个细胞出现染色体桥,异常频率为 6.69%;在 120个末期Ⅰ细胞中,有 6个细胞出现染色体落后的现象,异常现象的频率为2.50%;在 144个中期 II细胞中,有 18个细胞出现染色体桥,异常频率为 12.50%;在 142个后期 II细胞,有 20个细胞出现染色体落后的现象,异常现象的频率为 14.08%;另外在末期Ⅱ有 3.95%的细胞分裂不同步,四分体时期有 3%的三分孢子存在 (表1)。

图1 黄芩花粉母细胞减数分裂

表1 减数分裂各时期染色体行为异常的花粉母细胞百分率

2.2 花粉粒育性观察结果

随机取样,共观察统计了 1327个成熟花粉粒的醋酸洋红染色反应结果,其中不被染色或染色浅的、外形皱瘪的的花粉粒有 312个,可育花粉粒为76.49%,花粉败育率为 23.51%(图2)。

2.3 体细胞核型分析结果

图2 黄芩花粉粒醋酸洋红染色反应

从黄芩的大量细胞学制片中观察了根尖 50个细胞的中期染色体,确定黄芩的体细胞染色体数目为 2n=18。根据其花粉母细胞减数分裂终变期,同源染色体配对形成 9个二价体,可以确定黄芩为二倍体。未发现非整倍性变异和 B染色体,共测量了5个分散良好,着丝点清晰的中期细胞染色体,获得相应的 5个细胞的数据结果,计算平均值供核型分析 (表1)及核型模式图分析 (图3),同源染色体配对后的核型图见图2。结果表明:黄芩最长染色体和最短染色体的比值为 1.989,臂比大于 2:1的染色体的百分比为 0%,核型不对称系数为 1.9704,核型公式为 K(2n)=2x=18=16m+2sm,6号染色体具有随体,相对长度组成为 2n=1s+4M1+3M2+1L。黄芩的核型为“1A”对称型核型。

表2 黄芩染色体相对长度、臂比及类型

3 讨 论

图3 黄芩的体细胞中期照片和核型图

本研究还发现黄芩的少数花粉母细胞减数分裂过程中出现了染色体落后、染色体桥等异常现象,其中染色体落后的频率在减数分裂的中期Ⅱ和后期Ⅱ比较高,后期Ⅱ高达 14.08%,可能是由于某些染色体同源化程度不高造成的。潘泽惠等在观察伞形科植物减数分裂时认为,一些种类的染色体发生杂合性结构差异,致使减数分裂时产生双着丝点染色体,在后期 I形成染色体桥和断片[9]。王新宇等认为,额外的染色体断片是染色体直接断裂的产物,染色体桥是染色体断裂的间接产物[10]。李雪等认为兰州百合小孢子母细胞减数分裂异常是导致败育花粉产生的主要因素[11]。王恒昌等对秤锤树的研究发现,其减数分裂过程中断片、落后染色体和染色体桥出现的比例与花粉粒败育性比例比较一致,表明秤锤树的小孢子在发生和发育过程中较高频率的败育现象可能存在一定的细胞学原因[12]。落后染色体和染色体桥造成了染色体的不均匀分配,导致了减数分裂的一些异常结果,形成有遗传组成不平衡的配子,产生不同遗传组成的花粉粒,这是导致黄芩花粉败育 (花粉败育率 23.51%)的重要原因之一。

冯学锋等对黄芩 13个居群遗传多样性的研究表明,黄芩居群的遗传多样性与地理距离有一定关系,距离越远遗传差异越大,且居群内差异也较大[13]。同样本研究结果显示,河南禹州黄芩的核型公式为 K(2n)=2x=18=16m+2s m,为“1A”型,属最对称的核型,其中第 6号染色体具有随体;而唐晓清等 (2006)对江苏省赣榆县黄芩 (Scutellaria baicalensisGeorgi)的核型分析结果显示,其核型公式为 K(2n)=2x=18=10m+6sm+2st,为“2B”型,且没有观察到随体染色体[14]。细胞遗传学的研究表明,染色体是遗传物质的主要载体,染色体在结构或数量上的任何变化都会引起相应的遗传效应,从而导致更加丰富的遗传多样性。在染色体的形态结构变异中,染色体的长度、着丝点的位置、随体的有无、B染色体的数量及在不同居群中的分布等方面的变异,都可导致丰富的遗传多样性[15]。核型分析是在染色体水平上检测植物遗传多样性的方法之一,通过核型分析根据其核型的对称性、随体的特征等特点,对其遗传多样性加以评判。因此,本研究结果预示着生长在不同地区的黄芩在染色体水平上存在着遗传多样性。

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