微藻的固定化技术及应用研究▲

贺 敬 李 壮 王英娟 马 涛 蒋海亮(西北大学生命科学学院,陕西西安市 710069)

微藻的固定化技术及应用研究▲

贺 敬 李 壮 王英娟3马 涛 蒋海亮(西北大学生命科学学院,陕西西安市 710069)

微藻;固定化;应用前景

微藻作为当今研究的热点,具有生长速率快、油脂产量高、碳水化合物和其他营养成分丰富的优点,可用于生物制药、生产生物柴油、提取必需脂肪酸、激光医疗和污水处理等领域[1]。但由于微藻个体微小,常规的生物技术很难应用于微藻,而微藻的固定化技术恰恰解决了这一问题。固定化技术使微藻在污水处理、吸收富集营养、种质保藏、代谢物生产等方面的能力大大提高[2]。现对微藻的固定化技术的方法及其应用研究综述如下。

1 微藻的固定化方法

微藻固定化技术主要有吸附法、包埋法、偶联法[3～5]三种方法 ,见表 1。

1.1 吸附法 微藻细胞可通过静电吸附结合在固相载体表面。固相载体表面可形成单层和多层的微藻细胞层。由于,这种固定化技术操作简便,成本低廉,因此得到了广泛的应用。被固定的微藻结合的强度不一,固定微藻经常容易脱离进入培养液中,而培养液中悬浮微藻细胞也可吸附在固相载体表面,形成动态平衡。由于,该方法操作简单而常被用于微藻细胞的固定,但微藻细胞的截留量却因吸附载体不同而受到限制[6]。

吸附法常用的固相载体包括纤维素载体 (如二乙氨乙基纤维素、锯末、脱木素锯末等)和无机载体 (如坡缕石、高岭石、水云母、多孔瓷器、多孔玻璃等)。这些固相载体往往还需进行表面修饰以增强对微藻的吸附力,如玻璃、纤维素薄膜等载体则可经聚阳离子、壳聚糖或者其他化学物质的表面修饰后,用于微藻细胞的固定。

1.2 包埋法 包埋法是将微藻细胞截留在水不溶性的凝胶络合物的网络空间中,通过聚合作用,或通过离子网络形成,或通过沉淀作用,或改变溶剂、温度、pH值使细胞截留[7]。此方法具有高的保留容量,对细胞无毒性,但操作方法复杂[8]。包埋法常用的载体有:琼脂、藻酸盐、交叉菜糖、骨胶原、果胶等。

1.3 偶联法 具有多个相同功能基团的偶联剂,通过与微藻细胞表面的基团反应,从而使微藻细胞相互连接呈网状结构而达到固定的目的[9]。用此方法固定的微藻细胞不易流失,操作简单,但由于固定过程的剧烈反应,对微藻细胞产生一定的毒性,影响微藻细胞活力。常用的偶联剂有戊二醛、异氰酸、氨基硅烷、碳化二亚胺等。

就目前而言,微藻固定的三种方法中,吸附法和包埋法具有操作相对简便、成本较低、对细胞伤害较小等优点而常被采用。但吸附法细胞保留量较小,所以包埋法成为目前最为广泛应用的固定方法,而且包埋载体又以藻酸钙或 K2交叉藻聚糖较为适宜。

表 1 几种固定方法的比较

2 固定化对微藻的影响

微藻经固定后,生活环境的改变会对微藻细胞造成一定的影响。首先,固定微藻所用的树脂、高分子聚合物等有机载体对微藻细胞有一定的毒性[10],影响正常的细胞活力。其次,与自由悬浮培养的微藻相比,固定化的微藻具有一个较长的停滞期,当停滞期过后,固定化的微藻才会呈现出与自由悬浮培养的微藻细胞相似的生长曲线[11]。此外,固定化微藻形态会因固定化而受到一定程度的影响。Lukavsky等[12]比较了固定的 S.quadricauda、C.kessleri和其游离悬浮培养的形态,发现C.kessleri细胞的大小和形状未发生显著变化,但细胞器变得更多,开始出现淀粉粒;而 S.quadricauda出现了更多的异型细胞[12]。

固定之后,藻类的生长和生理特性发生了变化,可以提高对氮、磷和重金属等物质的吸收和富集。但是目前这方面的研究还很不系统,一般认为固定化提高了藻类的合成代谢活性,延迟衰老,并在一定程度上降低了藻类的分解代谢活性。

3 微藻固定化培养的应用

3.1 在传统的微藻悬浮游离培养中细胞增殖较快,但形成的次生代谢产物的量较少。相反,固定化培养不仅能使细胞生长速度减慢,便于营养物质,转化为次生产物,而且 a2海藻酸钠固定的微藻中可检测到类苯基丙烷复合物,这是非常重要的结果。

3.2 种质保藏 藻种长期较好地保藏可大大节省人力和物力,固定化技术可作为微藻种质保藏的重要方法之一[13]。Chan等[14]将 S.quadricauda、I.galbana用钙 -海藻酸钠包埋,在无培养基、4℃、暗光的环境中保存 3年后,将微藻细胞用新鲜培养基复苏,发现细胞依然具有活性,在四周内增殖了40代。Hertzberg等[15]用钙 -海藻酸钠包埋 P.tricornutum细胞,在暗光、4℃下保藏 1年,将其复苏后,微藻可释放氧气。Lukavsky等[16]用 2%的琼脂固定了 31种原核和真核微藻,在低温下保藏一年后,大多数仍具有代谢活性。Joo等[17]用钙 -海藻酸钠固定了 D.bardawil,C.minutissima,P.lutheri and H.pluvialis四种微藻,得到了比游离培养基更高的细胞密度。胡蓓娟等[18]对 8种微藻采用固定化和低温弱光 2种方法进行保存作了比较,发现只有三角褐指藻、蓝隐藻和小球藻较适合固定化保存。由此可见,固定化微藻的保种技术在某些藻类是可行的。

3.3 产生能源 氢气由于具有热值高、来源广泛、无污染的优点,因此是一种优良的燃料。生物合成氢气相比化学合成更环保、能源消耗更少[19]。一些微藻可在胁迫条件下产生氢气,如绿藻在缺少硫元素的时候由于不能合成光反应中关键蛋白而产生氢气[20,21]。因此,利用包埋法将微藻固定在特定胁迫条件的培养环境中,即用于产生氢气。Melis等[22]通过两步法在硫饥饿的培养条件下,间接光解制氢,基于固定化技术的培养条件使产氢量远高于一般的培养方法。有报道等[23]比较两种延长固定化硫饥饿微藻细胞 Chlamydomonas reinhardtii产氢时间的方法后发现,将固定化的微藻细胞交替置于高硫和低硫的培养环境中,可延长微藻的产氢时间。

3.4 脱氮除磷 利用富营养污水培养微藻,在提供了微藻生长所需的营养的同时,也降低了水体中氮磷的含量,从而使污水得到了净化,但这种培养系统占地面积大,成本高,微藻从中分离出来需离心过滤,耗时耗力。固定化微藻由于固定化载体对氮磷具有一定的吸附富集作用,对环境等的变化具有一定的缓冲作用,同时固定化微藻与自由悬浮微藻相比较,显示出更强的增长性和生理活性,使得固定化微藻具有处理效率高、对 pH值、温度、有毒物质和有机溶剂等环境变化承受能力强等优点[24,25],常被用于微藻培养的脱氮除磷中。Canizares等[26]对悬浮螺旋藻和角叉菜聚糖固定螺旋藻处理造酒废水进行了比较研究,悬浮藻对 NH4+2N、PO4

3-2P和总磷的去除率分别为 75%、98%和 53%,而固定藻对氮、磷的去除率均在 90%以上。王瑞旋等[27,28]将固定化波吉囊藻和微绿球藻引入凡纳对虾的养殖环境中,发现波吉囊藻对氨氮的吸收能力较强,而固定化微绿球藻对亚硝酸盐的吸收力较强。Aguilar等[29]分别培养壳聚糖固定的海洋蓝藻 Synechococcus和游离的 Synechococcus,用于吸收水体中的氮元素和磷元素,发现前者的吸收效率远高于后者。

3.5 去除重金属离子及其他污染物 重金属元素进入环境后,不仅造成资源浪费,更能造成严重的环境污染,对人类自身安全产生持久的威胁。重金属废水的传统处理方法主要有离子交换法、化学沉淀法、电解法、反渗透法、吸附法、不溶性络合物法、氧化还原法、蒸发浓缩法等[30,31]。这些方法技术要求较高,而且费时费力,容易造成二次污染。微藻固定化技术在增加单位体积生物量、提高处理负荷的同时,减少了解吸过程中微藻的损失量,并且固定化载体对重金属离子具有吸附富集作用,对其毒性具有缓冲作用,从而使得固定化微藻具有更高的处理效率和吸附量[32],在去除重金属离子及其他污染物方面优于传统处理方法。Ergene等[33]通过褐藻酸凝胶固定绿藻 Scendesmus quadricauda,用来去除水环境中的亮蓝颜料,发现在初始亮蓝燃料浓度为 150 mg/L、pH 2.0、30℃时,固定化的微藻具有非常高的吸收效率。严国安等[34,35]利用褐藻酸钠固定化的斜生栅藻对 Hg2+的去除率明显高于悬浮藻,并且污水中 Hg2+的浓度大小对于 2种状态斜生栅藻的去除率也有一定影响。

3.5 毒性检测 由于微藻细胞高的比表面积,使其对环境中不同的污染物具有较高的敏感性,因此在水污染监测中,微藻成为了一种重要的检测工具,也得到了美国环保署、国际经合与发展组织、国际标准化组织等的认可[36,37]。目前,已将固定化微藻引入环境监测,提高了检测的准确性和应用范围。Pandard等[38]用小球藻 Chlorella vulgaris和栅藻 Scendes mus subspicatus构建了在水相系统中工作的氧电极系统,发现除草剂非常敏感,与基于传递介质的系统在长时间的操作中具有更高的灵敏度。Detmar等[39]采用了莱茵衣藻 Chlamydomonas reinhardtii构建了光纤 pH的生物检测器,用来测定 pH值的变化,可用于环境中有毒化合物的早期监控。Maria等[40]将月牙藻 Selenastrum细胞固定在 2%的琼脂中,可以通过检测 pH的变化来测定重金属 Cr6+的量。

4 展 望

目前,固定化技术已经在污水处理、次生代谢物生产、种质保藏、环境检测、污水脱氮除磷、产生能源等方面展现出可喜的能力,借助微藻固定化技术,有可能早日突破实现微藻生物电池因为微藻的密度小、生长持续时间短、体积大等缺点而未能投入实际应用的瓶颈,服务于我们的社会。同时在固定的藻类细胞中,质粒具有良好的稳定性,可以降低突变的产生[41],使得微藻固定化技术应用于分子生物学领域具有一定的前景。虽然,固定化微藻已用于实际的污水脱氮除磷,但是由于目前微藻固定化技术的不完善,受到固定化材料的造价较高、没有开发出成型的固定化微藻传感器等[42]因素限制,还不适用于大规模的废水处理,其用于污水的生物处理和环境的生物监测方面还处于试验室研究阶段,有待于今后不断地努力和技术的革新,将微藻固定化推向广阔的应用实践中。

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R 943.1

A

167326575(2010)0620600204

国家自然科学基金项目 (编号:30970308),国家大学生创新实验项目(No:101069710)

3通讯作者

2010208225

2010210221)

·微创教学·