抑制消减杂交技术筛选肺炎链球菌多耐药相关DNA片段

李燕,宋瑱,冷平,熊辉,何洋

(1.成都中医药大学医学技术学院,四川 成都 610019;2.四川大学华西医院实验医学科,四川 成都 610041)

近年来,肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae,S.pn)对常用抗菌药物的耐药情况日趋严重,特别是对青霉素类、大环内酯类、四环素类、复方磺胺甲恶唑以及氯霉素等3种以上抗菌药物耐药的多耐药菌株(MDR)的出现,使肺炎链球菌所致重症感染的治疗成为难题。筛选肺炎链球菌多耐药相关DNA进行分析,有助于肺炎链球菌多耐药的分子机制研究,以及新的抗多耐药菌株药物靶点的设计。抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)是一种消减杂交与PCR结合的简单、快速分离差异基因的新技术[1]。经过不断改进和完善,已成为目前分离新基因的主要方法,是筛选耐药相关基因的有效手段。本研究以临床分离的肺炎链球菌多耐药菌株和抗生素敏感的标准菌株为研究对象,通过抑制消减杂交技术获得与多耐药相关的DNA片段,为进一步研究肺炎链球菌多耐药分子机制打下基础。

1 材料和方法

1.1 材料

肺炎链球菌多耐药菌株09062407分离自四川大学华西医院,K-B法药敏试验结果显示对四环素、阿奇霉素、氯霉素、克林霉素、复方磺胺甲恶唑均耐药。肺炎链球菌标准菌株ATCC49619由四川大学华西医院微生物实验室保存并提供,为上述抗菌药物敏感株。聚合酶链反应(PCR)选择性细菌基因组消减试剂盒购自Clontech公司,RsaⅠ酶购自MBI Fermentas公司,pEASY-T3克隆试剂盒购自全氏金公司,BM 2000分子量标准、2×PCR Master Mix、柱式DNA回收试剂盒、柱式质粒DNA提取试剂盒、TP10感受态细胞购自博迈德公司,PCR扩增仪为 Thermo公司产品,冷冻离心机为Beckman公司产品,电泳仪及凝胶成像系统为Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

基因组DNA提取及RasⅠ酶切。采用改进的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法[2]提取细菌基因组 DNA。分别将多耐药菌株 09062407和ATCC49619基因组DNA用RsaⅠ酶切,酚/氯仿抽提,无水乙醇沉淀,调整DNA浓度为300 ng/μl备用,酶切效果良好方可进行后续实验。抑制消减杂交采用PCR选择性细菌基因组消减试剂盒,实验所用接头及引物见表1。

表1 接头及引物序列Tab.1 Adaptor and Primer sequence

以临床分离多耐药菌株基因组DNA为被检方(tester),标准菌株A TCC 49619基因组DNA为驱动方(driver)。将tester的RasⅠ酶切产物分别与接头1、接头2R以 T4DNA连接酶连接,16℃反应过夜,然后分别以两种连接产物为模板,以23SRNA作为检查接头连接效率的基因,分别用23SRNA上、下游引物以及23SRNA上游引物和接头外侧引物1分别进行两种接头的连接效率检测。接有两种接头的tester分别与酶切后过量driver在98℃变性1.5 min、63℃杂交1.5 h,立即进入第二次杂交。两组第一次消减杂交的体系混合后加入变性的driver,63℃杂交过夜。稀释第二次杂交产物,以PCR引物1进行第一次PCR扩增。第一次PCR产物以巢式引物1和巢式引物2R进行第二次PCR扩增,并进行PCR产物消减效率检测。消减混合物进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定并成像。

消减杂交文库的构建。二次PCR纯化后产物2μl与pEASY-T3 1μl进行连接反应,连接产物转化TP10感受态细胞,经冰浴和热激后,涂布于含X-gal、IPTG的氨苄青霉素平板,培养过夜后得到蓝白单个菌落。随机挑选多个白色菌落。应用巢式引物l和巢式引物2R进行PCR初步鉴定。

2 结果

2.1 RsaⅠ酶切、接头连接效率分析

未经RasⅠ酶切的基因组DNA存在5kb弥散带,酶切后的产物弥散带在0.1～2.0 kb,酶切效果良好;将酶切产物分别与接头1、接头2R连接后,以23SRNA作为检查接头连接效率的基因,结果发现连有接头与未连接头的23SRNA基因的荧光强度相差不大,两者荧光强度之比小于4倍,连接效率＞25%,符合后续实验要求。结果见图1。接头连接的成功与否是消减杂交成败的关键,如果连接效率＜25%,应重新做连接实验。

图1 接头的连接效率分析Fig.1 Analysis of ligation efficiency

1:为以Tester1-1(连有接头1)为模板,23SRNA上、下游引物扩增的PCR产物;2:为以Tester1-1(连有接头l)为模板,23SRNA上游引物和PCR引物l扩增的PCR产物;3:为以Tester1-2(连有接头2R)为模板,23SRNA上、下游引物扩增的PCR产物;4:为以Tester1-2(连有接头2R)为模板,23SRNA上游引物和PCR引物l扩增的PCR产物;M为分子量标准

Lane 1:PCR products obtained using Tester1-1(Adaptor 1-ligated) as template with 23SRNA Forward and Reverse Primers;Lane 2: PCR products obtained using Tester1-1(Adaptor 1-ligated)as template with 23SRNA Forward and PCR Primer 1;Lane 3:PCR products obtained using Tester1-2(Adaptor 2R-ligated)as template with 23SRNA Forward and Reverse Primers;Lane 4:PCR products obtained using Tester1-2(Adaptor 2R-ligated)as templatewith 23SRNA Forward and PCR Primer 1;M:DNA marker.

2.2 抑制消减杂交结果

经过两轮消减杂交后的产物做两次抑制性PCR,第一次PCR产物少,且弥散,第二次PCR后,差异片段大量富集,电泳结果出现弥散分布带,大小200～1 500 bp,其中有明显富集的条带。结果见图2。

2.3 消减效率分析

图3 消减效率检测结果Fig.3 The results of subtraction efficiency analysis

消减效率分析以23SRNA管家基因在抑制性消减杂交产物中的丰度为参考,结果见图3。从图3可以看出,消减后的耐药株在28次循环后才看到23SRNA产物,说明消减效率良好。以未消减的对照(1-4)和消减的二次PCR产物(5-8)为模板,用23S上下游引物进行PCR扩增,1、5:为33次循环产物;2、6:为28次循环产物;3、7:为23次循环产物;4、8:为18次循环产物;M为分子量标准

PCR was performed on subtracted(Lane1-4)and unsubtracted (Lane5-8)secondary products with the 23SRNA Forward and Re

verse Primers,1 and 5:33 cycles;2 and 6:28 cycles;3 and 7:23 cycles;4 and 8:18 cycles;M:DNA marker.

2.4 消减文库构建结果

第二次PCR产物经纯化回收后和pEASY-T3克隆得到经蓝白斑筛选的消减克隆库。随机挑取192个白色克隆应用巢式引物l和巢式引物2R进行PCR后有155个克隆(阳性克隆的比例达80.7%)能扩增出单一片段,大小200～800 bp不等,图4显示其中9个克隆进行 PCR扩增产生的片段情况。

图4 菌落PCR结果Fig.4 The results of clonely PCR products

3 讨论

国内研究显示我国肺炎链球菌多耐药情况十分严峻,如上海地区2008年细菌耐药性监测网的监测结果显示:568株儿童非脑膜炎肺炎链球菌中对青霉素不敏感率达21. 5%,对红霉素和克林霉素耐药率则可达93.1%～97.8%,复方磺胺甲恶唑85.3%[3,4]。目前已知肺炎链球菌对青霉素的耐药机制主要是通过细菌青霉素结合蛋白基因突变,从而改变细胞壁上高分子量青霉素结合蛋白(PBP)结构,减少其对抗生素分子的亲和力而产生;对大环内脂-林可酰胺-链阳菌素类(MLS)药物的耐药机制主要是erm基因介导的核糖体甲基化修饰,可明显降低细菌与MLS类的结合能力以及主动泵出基因mef介导的主动外排作用;对喹诺酮类药物的耐药机制主要是由于2种拓扑异构酶-DNA转旋酶和DNA拓扑异构酶Ⅳ活性位点的共同改变[5,6]。但是否存在多耐药相关基因及其他耐药机制有待进一步研究。比较耐药株与敏感株之间的基因组差异,无疑对鉴定那些只在耐药株中存在的可能与耐药相关的基因区域有很大帮助,可以对肺炎链球菌耐药机制的深入研究开辟一条新途径。

抑制消减杂交技术是由Diatchenko建立的一种消减杂交与PCR结合的简单、快速分离差异基因的新技术。其运用杂交动力学原理,即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA,从而使不同丰度的单链DNA得到均衡;抑制PCR则利用链内退火优于链间退火的优点,使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构,无法作为模板与引物配对,选择性地抑制了非目的基因片段的扩增,从而使目的基因得到富集、分离,在一次抑制消减杂交反应中,可同时分离成百的差异基因,实现两个基因群之间的完整对比。因而,抑制消减杂交具有高特异性、高灵敏度、高效率等优点。经过Akopyants等[7]对抑制消减杂交技术的改良,用于细菌基因组比较分析,为病原体中未知基因的筛选和微生物基因组差异、分子进化的研究提供了重要的技术手段。目前,抑制消减杂交已用于细菌致病基因分离与鉴定[8]、细菌毒力差异及细菌种属进化关系的研究[9,10]等。

本次实验中以临床分离的多耐药菌株基因组DNA为被检方,标准菌株ATCC 49619基因组DNA为驱动方,通过抑制消减杂交,剔除了相同基因片段,而使耐药株与敏感株间差异片段大量富集,电泳结果出现弥散状分布DNA条带,大小200～1 500 bp,这些差异强化带可能包含有被检菌独有而参考菌缺如的片段,即与多耐药相关的DNA片段。将这些DNA片段富集后通过与pEASY-T3载体连接得到消减文库,随机挑取192个克隆经PCR扩增后有155个克隆能扩增出单一的DNA片段,大小200～800 bp不等,提示这些阳性克隆可能插入了高特异性的目的片段,可进一步通过克隆杂交、测序、基因结构分析、蛋白质位点及序列预测等生物信息学方法探寻肺炎链球菌多耐药相关基因及机制。

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