视网膜色素上皮细胞培养上清液联合视黄酸对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用

冯月兰 徐国兴 谢茂松

视网膜色素上皮细胞培养上清液联合视黄酸对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用

冯月兰1、2徐国兴1谢茂松1

1．福建医科大学附属第一医院眼科中心 2.内蒙古科技大学附属第一医院眼科

目的：探讨人类视网膜色素上皮(human retinal pigment epithe—lialium，hRPE)细胞培养上清液联合全反视黄酸（all-trans Retinoid Acid，RA）对骨髓间充质细胞(bone marrow stromal cells.BMSCs)诱导分化的影响。方法：实验分3组：RPE+RA+ BMSc共培养组,RPE+ BMSc共培养组,对照组。体外培养人视网膜色素上皮细胞(hRPE)和大鼠骨髓间充质干细胞(BMSc),取第2代HRPE和第3代BMSCc接种于Transwell双层培养板内共培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，采用免疫细胞化学染色检测胶质源性纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性标志物烯醇化酶(NSE)、光感受器特异性标志视紫质(Rhodopsin)在诱导细胞中的表达。结果：hRPE培养上清液+BMSCs+RA组诱导BMSCs更多的表达GFAP (84.57士6.68)％，NSE(56.29士6.51)％,和Rhodopsin (41.47士3.76)％；与RPE培养上清液+BMSCs组及单独BMSc组相比组间差异有统计学意义。结论：RPE培养上清液+BMSCs+RA可以诱导BMSCs向神经元、胶质细胞与视细胞分化。

骨髓间充质干细胞 视网膜色素上皮细胞 全反视黄酸 共培养 诱导分化

BMSCs是来源于骨髓的非造血干细胞，具有多潜能分化特性。与存在伦理学争议的胚胎干细胞及增殖能力有限的视网膜祖细胞相比，BMSCs以其具有自体同源性、易分离和操作简单等显著优势，成为视网膜细胞移植治疗的理想供体。已有研究表明，视网膜细胞培养上清液能够体外诱导胚胎干细胞向神经细胞分化[1]。本研究旨在探讨BMSCs诱导分化的条件培养基。

1 材料和方法

1.1 主要仪器

THERMO FORMA 3111 CO2培养箱（美国）；AIR-TECH BCM-1000A型生物洁净工作台（苏州）；OLYMPUS 1×70荧光倒置式相差显微镜（日本）；OLYMPUS PMCB20摄影器材（日本）；OLYMPUS BH-2型光学显微镜（日本）。

1.2 试剂

DMEM/F12培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶（均为Gibco公司）、PBS粉（Sigma）、实验用体重为80g清洁级sD大鼠。培养基（DMEM、DMEM／F12）、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；抗体为鼠抗人角蛋白-18单克隆抗体（北京中杉公司），小鼠抗大鼠神经元特异性标志烯醇化酶（NSE），星形胶质细胞特异性标志小鼠抗大鼠单克隆抗体神经胶质酸性蛋白(GFAP)，光感受器特异性标志小鼠抗大鼠单克隆抗体视紫质(Rhodopsin)，(均为Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 hRPE细胞的取材、原代、传代培养及鉴定

采用眼杯消化法[2]，沿角巩缘后3.5mm环形剖开眼球，弃除眼前节、玻璃体及神经视网膜获得眼杯，用0.25%胰酶消化获取HRPE细胞、15％胎牛血清的DMEM/F12培养液培养，细胞接近融合状态时进行传代培养。将第二代hRPE细胞置入六孔板中，孔板中放入18×18盖玻片，利用免疫细胞化学EnVision法检测角蛋白表达。

1.3.2 BMSCs的分离培养，传代培养及鉴定

清洁级SD大鼠，无菌条件下取出双侧股骨，从股骨干和胫骨干中间剪断，用10mLDMEM/F12培养液+20%FBS+肝素反复冲洗骨髓腔，冲洗液经200目不锈钢标准筛过滤掉大的团块后充分吹打混匀获取细胞悬液，接种于25cm2培养瓶中，置于37℃ 5%CO2的培养箱内培养。3d后首次换液，换液时倒除旧的培养液，加入含0.04%EDTA的PBS 4mL，37℃孵育10min，倒除PBS，加入新的完全培养液。当第3代MMSC细胞融合达80%~90%时，利用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD44和CD90表达对细胞纯度进行鉴定[3]。

1.4 实验分组

1.4.1 hRPE培养上清液+BMSCs+RA组：取二代hRPE细胞悬浮液含2000个细胞接种在transwell六孔双层培养板的上层，将BMSCs接种于下层培养板中，接种密度2.0×103个细胞/孔，在双层六孔板的每孔中加入终浓度为1μmol/L的RA，同时在下层放入18mm×18mm盖玻片进行细胞爬片，隔天换液。（还是每日半定量换液）倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.4.2 hRPE培养上清液+BMSCs组：取二代HRPE细胞悬浮液含2000个细胞接种在六孔transwell六孔双层培养板的上层，将MSC接种于下层培养板中，接种密度2000个细胞/孔，同时在下层放入18 mm×18mm盖玻片进行细胞爬片，隔天换液。倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.4.3 单独BMSc置于六孔板中爬片

2周后取出盖玻片进行GFAP，NSE， Rhodopsin，细胞化学染色。

1.5 免疫细胞化学染色

将双层六孔板中爬有HRPE和诱导前、后的BMSCs的玻片取出。

PBS润洗3min×3次；

4％多聚甲醛室温下固定20min，PBS冲洗3min ×3次；

0.1％TritonX.100室温下处理l0min，PBS冲洗3min ×3次；

3%H2O2去离子水孵育10min，阻断内源性过氧化物酶PBS冲洗3min ×3次；

羊血清孵育20min，封闭非特异性结合，勿洗；

适当稀释度的一抗（角蛋白 1:300），GFAP 1:100，NSE 1:10，Rhodopsin 1:25，4℃孵育过夜，PBS冲洗3min ×3次；阴性对照片为用PBS 代替一抗；

二抗（生物素标记的羊抗鼠IgG抗体）37℃湿盒孵育30min，PBS冲洗；

DAB显色6min；

苏木素复染；

中性树胶封片。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 hRPE以及BMSCs的取材和原代、传代培养参照文献[2]、[3]报告的方法

2.2 诱导分化的细胞形态学观察及鉴定

hRPE培养上清液+BMSCs+RA组共培养3d后原来梭行的BMSCs 胞体已发生收缩，呈锥形，细胞边缘变得不规整，有零星的细的突起（图1A）。在诱导后14d后，BMSCs 呈渐进性的向神经元样细胞转化，有较多的长突起，有些长突起末端形成生长锥样的膨大及丝性伪足呈典型的核周体形态，多极状（图1B）；同时BMSC在诱导7D后，部分细胞发生迁移并相互之间建立突触联系(图1C)。与ｈRPE培养上清液+BMSCs+RA组相比，不加RA则分化细胞明显减少，也少有建立突触联系的细胞（图1D）。

A：3d×400；B:14d×400；C:7d×400；单独BMSCs:D:×400；

2.3 统计学结果分析

利用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统分别对两种诱导条件下GFAP、NSE、Rhodopsin表达进行定量分析。

图2 不同指标与光密度关系

表1 不同诱导条件下光密度统计结果

阳性细胞统计结果见图3、表2。

图3 不同指标所表达阳性率

表2 不同诱导条件下所表达指标阳性率统计分析

3 讨论

BMSCs是目前备受关注的一群具有多向分化潜能的成体干细胞。具有高度可塑性，在一定诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化的能力。近年来，BMSCs 向神经细胞的分化研究受到了极大的关注。本试验所用到的RA是一种维生素A的代谢产物，它可以影响脊椎动物的发育和许多类型细胞的分化。RA常被用来进行诱导多潜能干细胞向神经细胞分化的研究，但机制尚不明确。RPE 细胞可分泌多种细胞因子这些细胞因子, 包括PEDF、FGF、 TGF2β、IL21 等。其中PEDF是一种多效的神经营养因子。对中枢及外周神经系统的许多部位的神经元具有神经营养、神经保护和神经分化作用；bFGF能诱导体内视网膜的重建，刺激所有源自中胚层的细胞以及许多源自神经外胚层和内胚层细胞的增生；bFGF可介导神经元的分化、对光感受器具有重要的保护作用；TGF2β可在正常RPE 细胞中表达。可调控细胞生长、分化、细胞外基质合成。本试验将三者共培养两周，结果显示：BMSCs可以高表达神经胶质细胞及神经元细胞特异性标志GFAP和NSE，同时我们还惊喜地发现诱导分化后的BMSCs表达光感受器细胞特异性标志Rhodopsin。这进一步证明了，BMSCs不仅可以向非间充质细胞转化，还可以跨胚层由起始的中胚层向外胚层发育，这为临床上进一步治疗视网膜和视神经疾病奠定了基础。

[1] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J]. Journal of Neuroscience Research, 2000, 61( 4 ): 364 – 370.

[2] Xu GX．In Vitro Primary Culture ofHuman RPE[J]．Int J Opbtbalmol,2004：4(1)：l2.

[3] 谢茂松,徐国兴等.大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养[J].国际眼科杂志,2007,7（5）:1285-1287.

福建省重点科研课题(基金编号：2008Y0040)。

徐国兴，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。