50种分枝杆菌标准株分枝菌酸指纹谱特征性研究*

王巨存 赵凤仪 王学谦 陈保文 王国治 陆 芸

50种分枝杆菌标准株分枝菌酸指纹谱特征性研究*

王巨存 赵凤仪 王学谦 陈保文 王国治 陆 芸

目的：构建50种分枝杆菌标准菌株的分枝菌酸（MA）指纹图谱库，并对该库指纹图谱进行比较研究。方法：选择50种标准分枝杆菌，经过接种、培养、皂化及酸化，提取到MA。MA衍生化后，采用高效液相色谱法（HPLC）进行分析，得到相应的指纹图谱。依据谱图的峰族数、相对保留时间及相对峰高详细分析与比对其特征性，并对所选92个临床分离株用本法进行鉴定。结果：通过对分枝杆菌MA的色谱分析，构建了50种分枝杆菌标准菌株的MA指纹谱库。图谱可分为3组，即单族峰型、两族峰型、三族峰型。每组分别包括10、23及17种。在92个临床分离株中，有89株的鉴定结果与已知结果一致，一致率为96.74%。结论：本研究所构建的指纹图谱全部具有特征性，对分枝杆菌的种间鉴定具有一定的参考价值。

分枝杆菌属 分枝菌酸 色谱法，高效液相 指纹图谱

近年来，结核病和非结核分枝杆菌（NTM）病的发病率均明显升高，分枝杆菌菌种鉴定不仅在流行病学上，而且在临床诊断和治疗上均有重要意义[1-2]。Butler等[3]研究并建立了高效液相色谱法（HPLC）鉴定分枝杆菌,但该法仅涉及16种分枝杆菌和2个复合群，不能满足临床细菌鉴定的需要。杜蓉等[4]报道的方法有8种分枝杆菌尚不能区分。因此，在前期工作的基础上[5-7]，笔者构建了50种分枝杆菌标准菌株的分枝菌酸（mycolic acids，MA）指纹谱库。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）标准菌株：鸟分枝杆菌（M.avium，25291），胞内分枝杆菌（M.intracellulare，13950），蟾蜍分枝杆菌（M.xenopi，19250），溃疡分枝杆菌（M.ulcerans，19423），土地分枝杆菌（M.terrae，15755），胃分枝杆菌（M.gastri，15754），不产色分枝杆菌（M.nonchromogenicum，19530），施氏分枝杆菌（M.shimoidei Tsukamura，27962）， 次 要 分 枝 杆 菌（M.triviale，23292），产鼻疽分枝杆菌（M.farcinogenes，35753），堪萨斯分枝杆菌（M.kansasii，12478），海分枝杆菌（M.marinum，927），猿猴分枝杆菌 （M.simiae，25275），亚洲分枝杆菌（M.asiaticum，25276），瘰疬分枝杆菌（M.scrofulaceum，19981），戈登分枝杆菌（M.gordonae，14470），苏加分枝杆菌（M.szulgai，35799），龟分枝杆菌龟亚种（M.chelonae subsp.chelonae，35752），龟分枝杆菌脓肿亚种（M.chelonae subsp.abscessus，19977），偶然分枝杆菌（M.fortuitum，6841），耻垢分枝杆菌（M.smegmatis，19420），草分枝杆菌（M.phlei，11758），抗热分枝杆 菌 （M.thermoresistibile，19527）， 爱 知 分 枝 杆 菌（M.aichiense，27280），金色分枝杆菌（M.aurum，23366），楚布分枝杆菌（M.chubuense，27278），杜氏分枝杆菌（M.duvalii，43910），微黄分枝杆菌（M.flavescens，14474），加地斯分枝杆菌（M.gadium，27726），浅黄分枝杆菌（M.gilvum，43909），科莫斯分枝杆菌（M.komossense，33014），新金色分枝杆菌（M.neoaurum，25795），奥布分枝杆菌（M.obuense，27023），副偶然分枝杆菌（M.parafortuitum，19686），罗德岛分枝杆菌（M.rhodesiae，27024），东海分枝杆菌（M.tokaiense，27282），猪分枝杆菌（M.porcinum，33776），灰尘分枝杆菌（M.pulveris，35154），塞内加尔分枝杆菌（M.senegalense，35796），诡诈分枝杆菌（M.fallax，35219），田野分枝杆菌（M.agri，27406），南非分枝杆菌（M.austroafricanum，33464），迪氏分枝杆菌（M.diernhoferi，19340），千田分枝杆菌（M.chitae，19627），田鼠分枝杆菌（M.microti，19422），非洲分枝杆菌（M.africanum，25420），母牛分枝杆菌（M.vaccae，29678），结核分枝杆菌（M.tuberculosis，95054），牛分枝杆菌（M.bovis，95055），均来源于美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）且由中国药品生物制品检定所分枝杆菌专业实验室提供，数字为ATCC编号，卡介苗（M.bovis，BCG）购自成都生物制品研究所。（2）临床分离株：26株由山东省胸科医院汉光国际感染性疾病研究中心提供（经细菌学和16 S rRNA基因测序鉴定）；18株由北京市结核病胸部肿瘤研究所提供（经细菌学和16 S rRNA基因测序鉴定）；25株由解放军总医院第二附属医院分枝杆菌专业实验室提供（经细菌学鉴定和16 S-23 S rRNA基因转录间隔区测序鉴定）；23株由天津市疾病预防控制中心结核病控制中心提供（经细菌学鉴定）。（3）仪器与试剂：高效液相色谱仪（515泵，486紫外检测器，Milennium2010色谱工作站，美国Waters公司）。甲醇、色谱纯和二氯甲烷（天津四友公司），十八冠醚-6（美国Sigma公司），4-溴苯乙酰基溴（美国Merck公司），高分子内标C-100（美国Ribi免疫化学公司）。皂化试剂为4.5 mol/L KOH溶液,以甲醇-水（体积比=1∶1）为溶剂。酸化试剂为5 mol/L盐酸溶液。中和试剂为0.2 mol/L KHCO3溶液，以甲醇-水（体积比=1∶1）为溶剂。衍生试剂为含0.1 mol/L的4-溴苯乙酰基溴和0.005 mol/L的十八冠醚-6的氯仿溶液。净化试剂为2.5 mol/L盐酸溶液以甲醇-水（体积比=1∶1）为溶剂。 改良罗氏培养基，按文献[8]方法配制。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养 将分枝杆菌接种在改良罗氏培养基，35℃培养至菌落形成。

1.2.2 分枝菌酸样品制备 分枝杆菌培养物经皂化、提取及衍生后置4℃冰箱中避光保存备用。上样分析前用200 μL二氯甲烷（CH2Cl2）溶解，0.45 μm 微孔滤膜过滤。

1.2.3 色谱条件 色谱柱为WatersSymmetry誖C18柱（3.9mm×150 mm，5 μm），流动相 A 为 CH3OH，流动相 B 为 CH2Cl2，流速为 1.5 mL/min。梯度为：0～13 min，30%～49%流动相 B；13～14 min，49%～30%流动相B；14～30 min，30%流动相B。柱温37 ℃，检测波长260 nm，进样量10 μL，信号采集延迟时间3 min。

1.2.4 分析方法 从谱峰的族数、相对保留时间（relative retention time，RRT）及相对峰高（relative peak height，RPH）方面直观分析与比对其特异性。分离株的鉴定：第1步根据样品图谱的特征与50种标准图谱比对得出初筛结果；第2步测定初筛结果确定的标准菌株样品，利用Milennium 2010色谱软件的图谱叠加功能进行比较，如两者的图谱基本一致，即可确定分离株的菌种名称。

2 结果

2.1 50种分枝杆菌标准菌株的MA指纹图谱 对分枝杆菌MA的色谱分析，构建了50种分枝杆菌标准菌株的MA指纹谱库。根据谱峰的分布情况可分为3组。A组:单族峰型，包括结核、牛、亚洲、非洲、田鼠、海、诡诈、次要、抗热及卡介苗分枝杆菌，共10种，典型图谱，见图1。B组:两族峰型，包括龟、脓肿、戈登、堪萨斯、溃疡、土地、偶然、耻垢、不产色、蟾蜍、爱知、胃、苏加、新金色、东海、草、微黄、迪氏、产鼻疽、田野、猪、千田及罗德岛分枝杆菌，共23种，典型图谱，见图2。C组:三族峰型，包括鸟、胞内、瘰疬、浅黄、南非、母牛、奥布、猿猴、金色、副偶然、灰尘、杜氏、加地斯、科莫斯、楚布、塞内加尔及施氏分枝杆菌，共17种，典型图谱，见图3。

2.2 临床分离株鉴定结果 山东省胸科医院提供的临床分离株，经细菌学和16 S rRNA基因测序鉴定为胞内（16株）、脓肿（3株）、戈登（2株）、瘰疬（1株）、偶然（1株）、堪萨斯（1株）、土地（1株）及结核分枝杆菌（1株），共26株临床分离株，采用本法鉴定，有25株的鉴定结果与其一致，另外1株结核分枝杆菌鉴定为胞内分枝杆菌；北京市结核病胸部肿瘤研究所提供的临床分离株，经细菌学和16 S rRNA基因测序鉴定为海、脓肿、耻垢、偶然、结核、胞内、浅黄、蟾蜍、金色、不产色、副偶然、爱知、土地、戈登、新金色、牛、鸟及堪萨斯分枝杆菌，各1株，共18株，本法鉴定的结果全部与其一致；解放军总医院第二附属医院提供的临床分离株，经细菌学鉴定和16 S-23 S rRNA基因转录间隔区测序鉴定为胞内（4株）、瘰疬（8株）、脓肿（1株）、戈登（4株）、堪萨斯（6株）、蟾蜍（1株）及结核分枝杆菌（1株），共25株，采用本法鉴定，有24株的鉴定结果与其一致，另外1株胞内分枝杆菌鉴定为偶然分枝杆菌；天津市结核病控制中心提供的临床分离株，经细菌学鉴定为结核（22株）和牛分枝杆菌（1株），共23株，采用本法鉴定，有22株的鉴定结果与其一致，另外1株结核分枝杆菌，鉴定为牛分枝杆菌。

采用本方法，鉴定了92株临床分离株，其中有89株的鉴定结果与已知结果（测序和细菌学鉴定）一致，一致率为96.74%。

3 讨论

分枝杆菌细菌学鉴定方法依据菌落的表型特征和生化反应，方法复杂费时，影响因素多，国内仅少数实验室能鉴定到种，基因测序方法也存在一定的局限性[9]。而应用HPLC方法分析比较分枝杆菌的MA指纹图谱的特征性，可实现分枝杆菌的种间鉴定[10]。

50种分枝杆菌由于其MA指纹图谱峰簇数的不同而分为3组，因此组之间得到了截然不同的区分，需要进一步讨论的是组内的差异。（1）A组（单族峰型）：结核与牛的RRT较为相似，牛分枝的峰1～7分别与结核分枝的峰2～8一致，但从RPH看，牛分枝的峰4＞峰3，结核分枝峰4＞峰5，两者相反，各具特征性。本组内其他分枝杆菌RPH的差异明显，各具特征性。（2）B 组（两族峰型）：龟、脓肿、戈登、堪萨斯、溃疡、土地、偶然、耻垢、不产色、蟾蜍及爱知分枝杆菌的特征性分析见文献[11]。爱知与罗德岛分枝杆菌的第Ⅰ簇与第Ⅱ簇峰在保留时间和相对峰高方面存在相似性，但爱知分枝杆菌在6.7 min处存在峰6，而罗德岛分枝杆菌在相应位置则没有，本组内其他各分枝杆菌RPH的差异明显，各具特征性。（3）C 组（三族峰型）：鸟、胞内、瘰疬、浅黄分枝杆菌的特征性分析见文献[11]，本组内其他各分枝杆菌RPH的差异明显，各具特征性。

3.1 8种分枝杆菌的特征性分析 胃分枝杆菌的峰11～17与结核分枝杆菌的峰1～7一致，但胃分枝杆菌MA指纹图谱属两族峰型，结核分枝杆菌属单族峰型；且结核与牛分枝杆菌MA指纹图谱不同，因此三者各具特征性。爱知、罗德岛分枝杆菌属于双簇峰，奥布分枝杆菌属于三簇峰；且爱知、罗德岛分枝杆菌MA指纹图谱不同,因此三者各具特征性。南非与母牛分枝杆菌都属于三簇峰，但二者的相对保留时间及峰高比显著不同，各具特征性。文献报道的方法不能区分结核、牛与胃分枝杆菌;爱知、奥布与罗德岛分枝杆菌;南非与母牛分枝杆菌[4]，而采用本方法则得到了区分。2种方法的流动相组成虽同为甲醇和二氯甲烷,但梯度条件,柱温不同,因此色谱分离效果是不一样的,这也是本方法的独特之处。

3.2 分枝杆菌临床分离株的鉴定 在建立50种分枝杆菌MA指纹图谱库后,进行了初步的应用研究。由实验结果可知，在92个临床分离株中，有89株的鉴定结果与已知结果一致，一致率为96.74%。表明对分枝杆菌的种间鉴定具有一定的参考价值。第4次全国结核病流行病学抽样调查所分离的非结核分枝杆菌（NTM）菌株包括鸟、胞内、蟾蜍、溃疡、土地、不产色、次要、堪萨斯、亚洲、瘰疬、戈登、脓肿、偶然、耻垢、爱知及浅黄分枝杆菌等[12]。

综上，本法所构建的50种分枝杆菌标准菌株的分枝菌酸指纹谱库涵盖上述NTM菌种，并且具有特征性，表明该指纹谱库在我国具有实用性，可以作为分枝杆菌细菌学鉴定和16 S rRNA基因及16 S-23 S rDNA ITS测序分析的补充方法。

[1] Jeong J,Kim SR,Chang CL,et al.Identification of mycobacteria species by HPLC and species distribution during five years at ulsan university hospital[J].Korean J Lab Med,2008,28（1）:24-33.

[2] 何国钧，肖和平．非结核分枝杆菌病的治疗研究进展[J]．抗感染药学，2005,2（2）:60-63.

[3] Butler WR,Floyd MM,Silcox V,et al.Standardized method for HPLC identification of mycobacteria[M].Atlanta:Centera for Disease Control and Prevention,U.S,1996:5-23.

[4] 杜蓉，陈保文，郭磊，等.基于分枝菌酸的分枝杆菌反相高效液相色谱分型鉴定方法[J].色谱，2008,26（5）:534-539.

[5] 王巨存，赵凤仪，王撷秀，等.高效液相色谱法分析分枝菌酸鉴定分枝杆菌[J].中华微生物学和免疫学杂志,2005,25（5）:374.

[6] 赵凤仪，王巨存，王撷秀，等.高效液相色谱霉菌酸分析方法的建立[J].中华检验医学杂志,2006,29（3）:264.

[7] 赵凤仪，王巨存，王撷秀，等.18种分枝杆菌标准菌株的分枝菌酸指纹谱比较[J].中华结核和呼吸杂志,2006,29（7）:470-473.

[8]中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程[J].中国防痨杂志，1996，18（1）:28-31.

[9] 彭涛，温博海，蹇锐，等.分枝杆菌临床分离株的16S-23S rRNA基因转录间隔区的序列分析[J].中国人兽共患病杂志，2004,20（9）:777-781.

[10]Minnikin DE,Minnikin SM,Hutchinson IG,et al.Mycolic acid patterns of representative strains of mycobacterium fortuitum,mycobacterium peregrinum and mycobacterium smegmatia[J].J Gen Microbiol,1984,130（2）:363-367.

[11]王巨存，赵凤仪，王学谦，等.我国临床常见非结核分枝杆菌标准株分枝菌酸指纹谱比较 [J].中华微生物学和免疫学杂志,2009,29（9）:815.

[12]李卫民，王甦民，张旭霞，等.采用16SrRNA序列分析方法鉴定第四次全国结核病流调的非结核分枝杆菌[J].结核病与胸部肿瘤,2004,33（1）:33-37.

Characteristic Fingerprintings of 50 Standard Strains of Mycolic Acides in Mycobacterium

WANG Jucun，ZHAO Fengyi，WANG Xueqian，CHEN Baowen,WANG Guozhi，LU Yun

Tianjin Hospital,Tianjin 300211,China

Objective:To construct fingerprinting library of 50 standard strains of mycobacteria by mycolic acid analysis using high performance liquid chromatography(HPLC)and the characteristic thereof.Methods:Mycolic acids were extracted,derivatized and analyzed by the HPLC method after inoculation,culture,saponification and acidification.The mycolic acid fingerprint library was set up.On the basis of HPLC patterns of relative retention time and relative peak height,the characteristic of the fingerprintings was analyzed and compared.Results:The mycolic acid fingerprinting library of 50 standard stains of mycobacteria was constructed by mycolic acid analysis using HPLC.These patterns may be divided into three groups,such as single-,double-and triple-cluster-peak-patterns,each group comprising 10,23 and 17 species,respectively.Fifty strains were successfully typed by the characteristics.Of 92 isolates tested,89 were given species names in concordance with the known names.The concordance rate was 96.74%.Conclusion:All of patterns have characteristics，which have definite values for identification above mycobacterium species.

mycobacterium mycolic acids chromatography,high pressure liquid fingerprintings

*天津市应用基础研究计划资助项目（项目编号：07JCYBJC08700）

300211 天津市天津医院（王巨存，赵凤仪，王学谦，陆芸）；中国药品生物制品检定所（陈保文，王国治）

（2010－03－24收稿 2010－05－16修回）

（本文编辑 陆荣展）