天津地区结核分枝杆菌可变串联重复序列多态性研究*

谢 彤 巨韩芳 赵德福 穆 成 赵 慧 吴振萍 王撷秀

天津地区结核分枝杆菌可变串联重复序列多态性研究*

谢 彤 巨韩芳 赵德福△穆 成 赵 慧 吴振萍 王撷秀

目的：分析天津地区流行结核分枝杆菌（MTB）基因组中分布的可变串联重复序列（VNTR）拷贝数目多态性，探讨不同MTB菌株分辨能力强的VNTR基因分型方法。方法：根据VNTR位点PCR扩增产物片段长度分析临床分离的102株MTB菌基因组中22个VNTR位点中重复序列拷贝数目，使用Hunter-Gaston分辨指数（H）评估各个VNTR位点的多态性和VNTR基因分型方法对菌株的综合辨别能力。结果：13个VNTR位点对不同MTB菌株具有较强的分辨能力，其分辨指数达0.996 3。其中QUB11b、11a、18、26，MIRU-26、31和Mtub21的多态性较好（H值为0.442~0.699）；MIRU-10、27、39、40，QUB1895 和 ETR-A 位点的多态性尚可（H 值为 0.203~0.316）；而 MIRU-2、4、16、20、23、24，QUB1451，ETR-B 和 C 的多态性差（H 值为 0.000~0.150），其中 MIRU-2、20、24 和 QUB1451 在北京家族菌株中没有多态性（H=0）。结论：选择多态性好的位点组合可以有效地区分不同的MTB北京家族菌株，建立起菌株分辨能力强的VNTR分型方法。

分枝杆菌,结核 串联重复序列 基因型 多态现象，遗传 流行病学,分子 天津

结核病分子流行病学研究通过基因分型技术准确地分辨不同的菌株，追踪结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB） 的传播途径，从而在结核病暴发流行时甄别结核传播链上的患者、追踪传染源、评估防控措施效果及确认实验室交叉污染等方面发挥重要作用。可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat，VNTR）分型是基于PCR技术建立起来的MTB菌株分型方法，VNTR以分布在基因组中VNTR位点所含重复串联序列拷贝数目不同来区分不同的MTB菌株。本研究通过评估天津地区分离MTB菌株中22个VNTR位点多态性，探讨临床菌株分辨能力强的VNTR基因分型方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集2005年10月—2006年9月天津市结核病控制中心102株临床MTB菌株。菌株分离自102例患者，其中初治患者81例，复治患者21例，男67例，女35例，年龄15~83岁，中位年龄36岁。83例患者在患病期间居住在天津市区，19例患者来自武清、东丽、宁河、北辰、蓟县及西青等6个区县。H37Rv标准菌株购自中国药品生物制品检定所。

1.1.2 主要试剂及仪器 细菌基因组DNA提取试剂盒购自申能博彩生物科技有限公司，Q-溶液购自德国QIAGEN公司，实验中引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。Taq酶为宝生物Probest和天根生物2×Taq MasterMix。VNTR分型结果应用PAUP 4.0软件进行分析。

1.2 方法

1.2.1 细菌基因组DNA提取 从L-J培养基中挑取一菌环MTB溶于500 μL PBS中，细菌经80℃，60 min灭活，使用CTAB法细菌基因组DNA提取试剂盒，操作步骤在BSL-2级生物实验室中按说明书进行。提取得基因组DNA溶于50 μL灭菌去离子水中。

1.2.2 MTB北京家族株鉴定 MTB北京家族株鉴定采用Warren等[1]报道的方法。即PCR方法扩增该家族基因组中所特有的IS6110插入序列与Rv2820之间的序列，引物为Bj_F 5′-TTCAACCATCGCCGCCTCTAC-3′,Bj_R 5′-CACCCTCTA CTCTGCGCTTTG-3′；非北京家族则扩增北京家族MTB基因组缺失片段Rv2819，引物为n-Bj_F 5′-GATCGCTTGTTCTC AGTGCAG-3′，n-Bj_R 5′-CGAAGGAGTACCACGTGGAG-3′。PCR反应采用 25 μL体系，2×Taq MasterMix（天根生物）12.5 μL，引物的终浓度为 0.4 μmol/L，模板 DNA 为 10~100 ng。扩增条件均为 95℃5 min变性后，94℃ 30 s；58℃40 s；72℃30 s，30个循环，最后经72℃10 min。若MTB为北京家族，则PCR扩增片段长度为393 bp，而非北京家族PCR扩增片段长度为570 bp。

1.2.3 VNTR PCR分析 对研究中所有菌株22个VNTR位点进行PCR扩增，引物序列参照文献[2]报道。经预实验优化，PCR 反应在含有 200 μmol/L dNTP，0.4 μmol/L 引物，1.5 mmol/L MgCl2，1.5 U Taq酶和10~100 ng基因组 DNA的25 μL体系中进行。经95℃5 min变性后，热循环温度条件为95℃45 s；52~60℃1 min；72℃1 min，共 30个循环。为增强PCR反应效率，MIRU-26，QUB18、1451位点PCR反应体系中加入5 μL的Q-溶液。PCR产物经1.5%~2.0%琼脂糖凝胶电泳后，使用Quantity One凝胶分析软件测定产物的分子质量，并与H37Rv标准菌株进行比较，以确定临床分离菌株中每个VNTR位点中重复序列的数目。

1.2.4 VNTR位点多态性分析 实验中每个VNTR位点的多态性评估和VNTR位点组合对菌株的鉴别能力采用Hunter－Gaston 指数（Hunter－Gaston discriminatory index，H）进行评价，其计算公式为算，N为实验菌株总数，S为VNTR分型中实验菌株不同基因型的数目，nj为第j个基因型的菌株数。

1.2.5 VNTR基因分型结果分析 VNTR分型结果采用PAUP软件分析，将实验中所获得的VNTR分型结果字母化后，编辑Nexus格式程序文件，采用除权配对法（unweighted pair-group method of arithmetic averages，UPGMA） 绘制系统树，基因分型完全相同的MTB菌株称为基因分型成簇株，从不同的患者中分离的菌株基因分型成簇则提示这些肺结核患者之间可能存在着相互传播。

2 结果

2.1 MTB北京家族株流行 使用PCR分别扩增北京家族和非北京家族基因组差异序列，在所分析的102株菌中，93株（91.2%）为北京家族株。

2.2 VNTR位点的基因多态性 应用针对VNTR位点两侧序列的引物分别扩增22个VNTR位点，表1显示了研究中所使用的22个VNTR位点在所分析的102株MTB菌株中的多态性。QUB11b、18、11a的多态性较好，H值分别为 0.699、0.630和0.574。在MIRU位点中，MIRU-26的H值为0.543，在所分析的菌株中该位点的串联重复序列的拷贝数目为2~11，见图1。选择在多态性较好的13个VNTR 位 点 ， 包 括 QUB11b、18、11a、26、1895，MIRU-10、26、27、31、39、40，Mtub21 和 ETR-A，作为天津地区流行菌株的VNTR基因分型位点组合H值达到0.996 3，而目前在VNTR分型中经常使用的12个MIRU位点对天津地区分离菌株分辨指数仅为0.870 4。

表1 结核分枝杆菌基因组VNTR位点多态性

2.3 VNTR分型聚类分析 VNTR分型结果系统树图，见图2。使用本研究中所选择的13个VNTR位点对临床分离的102株MTB进行基因分型研究。102株MTB被分为3个基因群。第1、2个基因群中分别含有4株和5株MTB，其余的93株北京家族组成第3个基因群。所有菌株被分为88个基因型，其中78个基因型为菌株独特型（基因型仅包含1株MTB菌），其余10个基因型中每个基因型包含2~4株基因分型相同的MTB菌株，形成基因分型簇株。

3 讨论

VNTR位点广泛存在于人类及细菌的基因组中，几乎所有的VNTR位点都位于非编码区，是以同一种短序列重复串联为特征，其序列重复的次数具有高度的个体特异性。VNTR基因分型就是利用菌株间基因组内VNTR位点的拷贝数目不同而分辨不同的菌株。早期的MTB基因分型研究中，不同的研究部门使用不同的VNTR位点组合，一般仅使用5个被称之为ETR的VNTR位点组合对MTB进行基因分型研究。随后的其他研究中利用MTB基因组中其他的VNTR位点，包括QUB位点组合、Mtub位点组合，开展对MTB的基因分型研究。Mazars等[3]采用的12个MIRU位点组合使用最为广泛。但随着研究的不断深入，Scott等[4]发现与传统的限制性片段长度多态性（RFLP）基因分型相比，12个VNTR位点对MTB株的鉴别能力不强，特异性低。若以此对MTB分型会引起成簇菌株的分类错误，过高估计MTB的近期传播，因此12个MIRU位点不适宜用于以人群为对象的大规模结核病分子流行病学研究。

天津地区流行菌株中北京家族占91.2%，与柴利泉等[5]的报道相近。本研究中12个MIRU位点对天津地区流行菌株分辨指数仅为0.870 4，而其他一些地区研究中MIRU位点对北京家族有较好的分辨率（H=0.975）[6]，提示在天津地区流行的MTB菌株，特别是北京家族株的多样性较低，这一家族在天津的传播可能主要由近期传播所导致。Kam等[7]研究提示某些QUB位点在MTB中的多态性较高，在北京家族株中11a和11b位点H值分别为0.514和0.669，这与本研究中（0.531和0.675）的结果相近。此外，Kam等发现Qub3232位点的多态性非常高，但在一些菌株中此位点无法扩增，Supply等[8]的研究也发现此位点难于扩增。

本研究中QUB26位点的H指数为0.566，高于Kam等[7]人报道，与Smittipat等[2]的研究相近。此外Smittipat等[2]对VNTR位点多态性的评估研究中提示Mtub21对于北京家族的H指数高达0.694，国内最新研究报道为0.570[9]，本研究中该位点在北京家族菌株中的H指数为0.397，与Mokrousov等[10]最新报道（H=0.330）相近。笔者认为对北京家族菌株中同一个位点在不同研究中分型指数出现差异主要是由于当地流行菌株的差异造成的，因为即使是北京家族株，其在人群传播过程中会形成多个进化分支。最新研究证实在不同的北京家族流行地区其主要流行株的亚型并不相同[11]。综上，笔者认为一个地区开展以人群为基础的大规模VNTR分型研究时，有必要对该地区部分流行菌株的VNTR位点的多态性进行综合评价，以确定VNTR位点组合，提高VNTR分型对不同MTB菌株的分辨能力，在MTB北京家族高流行区某些QUB位点可以显著提高VNTR基因分型对不同菌株的分辨能力。

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Polymorphism of Variable-Number Tandem Repeat in Mycobacterium Tuberculosis Strains Isolated from Tianjin

XIE Tong,JU Hanfang,ZHAO Defu,MU Cheng,ZHAO Hui,WU Zhenping,WANG Xiexiu

Tianjin Centers for Disease Control and Prevention,Tianjin 300011,China

Objective:To investigate the polymorphisms of variable-number tandem repeat(VNTR)in Mycobacterium tuberculosis（MTB）,and develop high discriminatory power of VNTR typing.Methods:The copy numbers of 22 known VNTR loci(12 MIRU,3 ETR，6 QUB and Mtub21)were analyzed among 102 MTB strains isolated from Tianjin according to the size of PCR fragments.Polymorphisms of each VNTR locus and discriminatory power of optimized VNTR loci set were assessed using Hunter-Gaston index respectively.Results:The 13 VNTR loci set(MIRU-10,26，27,31,39，40,QUB11b，11a，18，26,1895,ETR-A and Mtub21)optimized in this study had the high discriminatory power with H=0.996 3.QUB11b，11a，18，26，MIRU-26，31 and Mtub21 showed the high polymorphism(H:0.442-0.699).The discriminary power of MIRU-10,27,39,40,QUB1895 and ETR-A were moderate(H:0.203-0.316).Other loci including MIRU-2,4,16,20,23,24,QUB-1451,ETR-B and C were poorly polymorphism （H:0.000-0.150）,of which 4 loci(MIRU-2，20，24 and QUB-1451)had no polymorphism at all in Beijing genotype.Conclusion:The optimized 13-VNTR loci set were highly discriminative for Beijing family.The number and combination of informative VNTR loci for epidemiological study need to be determined according to the locally prevalent strains.

Mycobacterium tuberculosis tandem repeat sequences genotype polymorphism，genetics epidemiology,molecular Tianjin

*天津市科委应用基础研究资助项目（项目编号：07JCYBJC08800）

300011 天津市疾病预防控制中心

△通讯作者 E-mail:drzdf@163.com

（2010－05－23收稿 2010－07－10修回）

（本文编辑 李鹏）