PCR-DGGE在废水生物处理技术中的应用

熊 毅 赵 璟 赵 鑫

（1.重庆市设计院，重庆 400015）

（2.中国石油天然气管道工程有限公司天津分公司，天津 300280）

（3.大港油田滩海开发公司，天津 300280）

1 引 言

作为一门现代生物学，分子生物学（Molecular Biology）是在生物化学与遗传学、微生物学、细胞学、生物物理学等学科相结合的基础上发展起来的崭新学科.它将研究对象主要集中于细胞大分子—蛋白质与核酸，通过研究生物大分子之间相互关系和作用，从分子水平上对生物体的多种生命现象进行研究.分子生物学技术不仅节省了传统培养方法的时间，避免了经典微生物技术在多样性研究中的局限性以及由此引起的种群丢失、种群结构不清等弊病，提高了检测的灵敏度，也可以更可靠、更直接地反映微生物多样性在生态系中原始构成情况，而且它们的运用能对环境样品中的微生物进行原位观察，充分反映样品中原有的微生物组成情况，能有效、快速地得到环境样品的微生物信息.随着时间的推移，分子生物学技术越来越成熟，特异性越来越强，如今已能检测特定微生物群落的动态变化和活性.

废水生物处理技术研究中分子生物学检测技术的应用始于1990年代中期，主要采用的检测技术包括荧光原位杂交技术（Fluorescent In Situ Hybridazation，FISH）、多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）、DNA测序及序列分析等.文章针对目前在废水生物处理微生物检测中通常采用的 PCR-DGGE检测技术优缺点及其在废水处理新工艺中的应用进行述评，以期对该技术在废水生物处理中的实用价值有全面深入的了解.

2 PCR-DGGE技术的优缺点

2.1 PCR-DGGE方法的优点

PCR-DGGE的结合是目前进行微生物鉴定、原位观测中最为有效也是广泛采用的方法，主要优点有以下几个方面：[1]

1）不需要培养直接从所研究的样品中抽提总DNA，然后对16S rRNA的可变区进行PCR扩增，扩增产物通过变性梯度凝胶电泳（DGGE）进行分析，能检测到难以培养或不能培养的微生物，发现一些原来没有检测到的新的微生物种类.PCR-DGGE基本工作流程见图1.

图1 PCR-DGGE基本工作流程

2）检测极限低

Muyzer[2]等用这种方法能检测出数量仅占总群落数1%的微生物.Omar等[3]证实PCR-DGGE技术检测极限大约为1%～3%，如果结合使用rRNA杂交技术,还可使检测极限降至0.1%左右.

3）检测速度快、经济

Omar等[4]利用该法实时实地地研究了墨西哥玉米面团Pozol在发酵过程中不同阶段微生物种类和数量发生了动态变化.PCR-DGGE方法能在取样后8小时内得到结果，能够实时监测样品状态，因此可以根据实际需要迅速作出调整.

4）结果准确可靠

传统的生化鉴定方法虽然也能对细菌进行鉴定，但会出现假阳性或假阴性结果，主观性比较强，而且会漏掉一些不能培养的微生物.而PCR-DGGE方法则能客观完整地鉴定微生物，结果也很直观，它根据参考菌株和样品微生物16S rRNA的PCR扩增产物在凝胶中的相对位置来进行判断.若将凝胶上的条带切割下来测序，然后与基因库中的标准序列进行比较，就可以得出它们的遗传相关性.[3]

5）同时检测多种微生物

DGGE凝胶上至少可以区分10个清晰可辩的条带，每个条带可能来自不同的微生物.

6）与其它方法结合

DGGE可以和许多方法结合，从而全面认识微生态的组成、优势菌群等.实际上，这种结合起来的方法目前被认为是研究环境微生物真正的系统发育的最有力的手段.近些年来，,这一观点得到了强调和重视.PCR-DGGE可以和传统方法、糖和发酵产物分析、杂交技术、测序技术等结合起来，且都能得到较好的结果.

2.2 PCR-DGGE技术的局限性

任何方法都有一定的偏差，分子技术虽然可以避免传统方法的不足但也有其自身的缺陷.[4,5,6]

首先，它在制样和样品处理的过程中可能产生一定偏差.清洗、混匀、冷冻或离心等步骤严重影响了微生物的生存，造成菌种的改变或菌数的变化.DNA的抽提更会导致对样品中微生物的选择，而且菌数的不同也会影响DNA的提取浓度和检测限.另外环境微生物生长的基质（脂类、蛋白质、碳水化合物、盐类等）越复杂，抽提就越困难，去杂就越不容易，而这些残存的杂质很可能会成为抑制剂影响PCR的扩增.因此首先要对DNA的提取进行优化，提高抽提率及DNA产物的纯度.

PCR技术本身也存在不足，1992年Reysenbach发现用rDNA基因在PCR过程中会产生优先扩增现象，只扩增部分细菌的DNA，造成了群落中原始成员的减少.另一个问题就是嵌合体的形成或异源双链的产生.它会影响 DGGE图谱中条带的分布.DGGE只能分离较小的片段(1 kb以下)，较长的片段分离率下降，这就限制了系统发育分析和探针的序列信息量.

其次，若选用的条件不是特别适宜，DGGE并不能保证可以将有一定序列差异的DNA片段完全分开，可能会出现不同序列DNA的共迁移现象.再者，有些细菌具有多操纵子，使同一种菌的DGGE图谱上出现多条带，从而高估了样品中微生物的多样性.

DGGE另一个突出问题是关于分辨率和检测限的问题.通常该法只能检测到优势菌的存在.Muyzer的研究表明，只有占整个群落细菌数量约 1%或以上的类群能被检测到.事实上，检测限和样品中微生物浓度也有很大关系，该法的检测范围一般为104～108 cfu/ml.检测限度也取决于具体的菌种或菌株.一般微生物群落中其他成员的浓度和数量也会影响目标菌的检测限，因为它们可影响DNA的抽提率，并在PCR扩增时竞争模板.

表1 DGGE技术的主要优缺点

3 PCR-DGGE在废水生物处理新技术中的应用

废水生物处理新技术主要是指近年来不断开发出来的新型脱氮除磷技术.尤其是在生物脱氮过程中，近年来出现了一些超出人们传统认识的新现象，这些现象的发现为水处理工作者设计处理工艺提供了新的理论和思路，开创了一些生物脱氮的新途径和方法，并由此开发出一些新型的脱氮工艺，它们逐渐成为各国学者研究的焦点.目前世界上正进行研究的这类工艺主要包括 SHARON、ANAMMOX、CANON以及OLAND等.本节围绕PCR-DGGE技术在新型脱氮工艺中的研究应用，对PCR-DGGE技术在废水生物处理新技术中的应用作一综述.

3.1 SHARON工艺

SHARON（ Single Reactor High Activity Ammonium Removal Over Nitrite）工艺由荷兰Delft技术大学Hellinga等人于1997年开发成功.该工艺包括两个步骤，即首先控制水中的氨氮转化过程，使硝化过程仅仅进行到亚硝化阶段，接着进行反硝化，水中的亚硝酸盐氮在缺氧条件下由反硝化菌转化为氮气而脱除.由于无须生成硝酸盐氮，因而可以节省能量的消耗和电子供给体.

SHARON工艺的技术关键在于如何将氨氧化控制在亚硝酸盐阶段，其本质就是如何使亚硝化菌相对于硝化菌成为优势菌种.采用常规微生物手段的研究焦点主要集中在如何培养、分离亚硝化菌上，很多学者在这方面进行了大量研究，比如找到了适合亚硝化菌生长的培养基、掌握了一些亚硝化菌的生理特性等.[7]但是这些研究通常耗时很长，效率较低，有时仅亚硝化菌的富集就需要60d.[8]而且由于肉眼在辨别筛选菌落的过程中无法精确判断，这使得有些功能菌很可能被人为忽略掉.而分子生物学无需对工艺中微生物进行纯培养，可以在一次实验中发现可能存在的所有菌种并且得到精确判断，避免了常规培养中的人为误差，节省人力物力.首次对SHARON工艺中的微生物组成情况应用现代分子生物学技术进行研究的是 Susanne等人.[9]他们认为，既然SHARON工艺在反应过程及工况控制上与传统脱氮工艺大有区别，其反应器内的微生物群落也有可能与传统工艺不同.基于这一认识，他们首先采用PCR-DGGE 16S rRNA序列分析，发现反应器内至少存在四种不同微生物，通过与 16S rRNA基因库内数据对比分析，发现其中有一种占主导地位（69%）的细菌与Nitrosomonas europaea有98.8%的相似性.

3.2 ANAMMOX工艺

1990年荷兰Delft技术大学的Kluyver生物技术实验室首次发现了厌氧氨氧化现象（Anaerobic Ammonium Oxidation，ANAMMOX)，即在厌氧条件下，微生物以NO2-为电子受体，NH4+为电子供体，将NH4+、NO2-转变为氮气.与传统硝化—反硝化生物脱氮途径相比，这一过程节省大量能耗，因而将成为废水脱氮领域中一种经济有效的处理手段.

在厌氧氨氧化基础理论研究方面，对具厌氧氨氧化功能的细菌分类研究一直是重点之一.虽然ANAMMOX菌广泛存在，在土壤干湿界面、海底缺氧环境、海湾都有厌氧氨氧化现象发生，但由于ANAMMOX菌生长缓慢，对氧敏感，且只有在高浓度时才显示出活性，使得传统的微生物培养方法至今还没有获得ANAMMOX菌纯培养物[10].而现代分子生物学技术的发展，为鉴定环境中的细菌提供了有力的工具，在厌氧氨氧化细菌的分类研究中起了至关重要的作用.

Strous等[11]最先采用PCR-DGGE技术测定了一种厌氧氨氧化细菌的16S rDNA序列，最终确定出他们发现的厌氧氨氧化菌在细菌进化树上的位置，研究表明该种细菌属于浮霉状菌目(Planctomycetales)，并命名为 Candidatus Brocadia anammoxidans.为鉴定菌群中的厌氧氨氧化菌，B.anammoxidans的16S rDNA基因序列被用来设计为特定的寡核苷酸探针，以用于荧光原位杂交（FISH）.Schmid等[12]基于PCR-DGGE方法在德国几个污水处理厂发现了一种新的 16S rDNA序列，这些序列形成一个明显独立的种群，其中有85 %的细菌与已发现的B.anammoxidans的16S rDNA序列相似性少于90%.因此，这种新的厌氧氨氧化菌 被 命 名 为 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis.Egli[13]在瑞士Kolliken附近处理有毒废物垃圾填埋场的生物转盘中富集到一种厌氧氨氧化菌，用 16S rDNA鉴定，16S rDNA序列与B.anammoxidans有 90.9%相 似 ， 而 与 K stuttgartiensis有 98.5%～98.9%相似，可认为是 K. stuttgartiensis细菌.

迄今为止，用 PCR-DGGE无需纯培养，已经鉴定出5个ANAMMOX 菌种，它们是Candidatus“Brocadia anammoxidans”、Candidatus “Kuenenia stuttgartiensis”、Candidatus “Scalindua brodae”、Candidatus “Scalindua wagneri”、Candidatus“Scalindua Sorokinii”，均属于浮霉状菌目.由于至今未能成功分离得到纯菌株，因此尚未获得正式命名和分类.但目前又有研究表明，自然环境中还存在一种以前未被发现的可进行厌氧氨氧化的细菌.雒怀庆、胡勇有采用分子生物学方法从已培养的具有厌氧氨氧化活性的污泥中提取细菌总DNA，经纯化、特异引物PCR扩增、克隆、测序等过程，进化分析结果显示培养获得的细菌与已发现的Candidatus Brocadia anammoxidans、Anaerobic ammonium-oxidizing Planctomycete、 Uncultured anoxic sludge bacterium KU1 细菌在进化上关系较近，但比对分析结明所研究的细菌与上述细菌的DNA序列相似度不高.

3.3 CANON/OLAND工艺

CANON（Completely Autotrophic Nitrogen Removal Over Nitrite）工艺首先由荷兰Delft大学提出，其微生物学原理为：亚硝化菌在有氧条件下把氨氧化成亚硝酸盐，厌氧氨氧化菌则在无氧条件下把氨和亚硝酸盐转化成氮气，即利用亚硝化菌和厌氧氨氧化菌的协同作用，在同一个反应器中完成亚硝化和厌氧氨氧化.OLAND（限氧自养硝化—反硝化，oxygen limited autotrophic nitrification and denitrification）工艺是1998年由比利时根特大学微生物生态实验室开发研制的，是部分硝化与厌氧氨氧化相耦联的生物脱氮反应系统.该工艺通过限氧调控（溶解氧0.1～0.3 mg/L）实现了硝化阶段亚硝酸盐的稳定积累，并实现了生物脱氮在较低温度（22～30℃）下的稳定运行.虽然OLAND强调的是控制溶解氧，但是，从OLAND和CANON的反应条件和反应情况来看，二者可能是同一机理，只是由不同的人发现而冠以不同的名字而已，还需要人们进一步的试验和考证.

荷兰Delft大学Sliekers等[14]应用分子生物技术发现CANON工艺中可能存在三种微生物：类亚硝化单胞菌的好氧氨氧化菌、类浮霉状菌的厌氧氨氧化菌以及氧化亚硝酸盐的硝化菌和硝化螺菌，并分析了它们在系统中的相互反应与竞争关系.Egli等[15]人则分析了生物膜CANON工艺的生物构成和基质代谢的途径.董远湘[16]等人用 PCR-DGGE技术对OLAND中硝化阶段不同时期的生物膜中微生物的种群动态变化进行了分析.研究表明，群落结构和优势种群的数量具有时序动态性，微生物多样性与废水的处理效果出现协同变化的特征.测序结果表明，在生物膜中进行氨氧化作用的主要为亚硝化杆菌（Nitrosomonas sp.）、亚硝化螺菌（Nitrosospira sp.）；进行亚硝酸氧化的主要为硝化球菌（Nitrococcus sp.）.张丹等人[17]考察了生物脱氮系统中硝化菌群（氨氧化菌和亚硝酸氧化菌）种群多样性及硝化菌群随溶解氧降低的种群变化规律，采用DGGE分子检测技术对硝化菌群的16S rDNA的特异性 PCR扩增产物进行了分析,结果表明：OLAND生物脱氮系统中氨氧化菌和亚硝酸氧化菌随溶解氧的降低表现出了不同的种群变化规律，氨氧化菌种群多样性受溶解氧的影响非常大，而亚硝酸氧化菌的种群多样性比较单一,且不受溶解氧的影响.在OLAND限氧稳定运行后期，亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）是主要的氨氧化菌,占OLAND限氧亚硝化阶段反应器中总细菌数的72.5%左右.

4 未来的展望

以PCR-DGGE为代表的现代分子生物学的发展为废水生物处理新工艺中的微生态与微生物特性提供了强有力的方法和手段.通过检测废水生物处理中微生物种群DNA序列多态性、鉴定个体基因，就可以在基因水平上评价种群的遗传分化，并在分子水平上阐述分子适应等生态问题的机制，这对更好地揭示废水生物处理新技术中微生物与环境之间的生态学关系以及为实现新型脱氮工艺系统的优化运行具有深刻的理论研究意义与实际应用价值.

[1]付琳林，李海星，曹郁生.利用变性梯度凝胶电泳分析微生物的多样性[J].生物技术通报，2004（2）:38-40.

[2]Muyzer G, Wall DE. Appl Environ Microbiol[J].1993，59:695-700.

[3]Omar NB , Ampe F. Appl Environ Microbiol[J].2000，66:3664-3673.

[4]刘志培，杨惠芳.微生物分子生态学进展[J].应用与环境生物学报，1999，5(Suppl):43-48.

[5]高蕙文，吕欣，董明盛.PCR-DGGE指纹技术在食品微生物研究中的应用[J].食品科学，2005，26（8）: 465-468.

[6]马悦欣. Holmstrm C., Webb J., Kjelleberg J.变性梯度凝胶电泳(DGGE)在微生物生态学中的应用[J].生态学报，2003，23（8）:1561-1569.

[7]曾国驱，许玫英，梁燕珍等.亚硝化细菌的分离和特性的研究[J].生物技术，2005，15（1）:27-28.

[8]郑金来，李君文.几株亚硝化菌的筛选及初步鉴定[J].上海环境科学，2002，21（5）:291-293.

[9]Susanne L. Molecular microbial diversity in a nitrifying reactor system without sludge retention[J].FEMS Microbiology Ecology，1998，27:239-249.

[10]Jetten MSM , Cirpus I , Kartal B, et al. 1994—2004：10 years of research on the anaerobic oxidation of ammonium[J].Biochem1 Soc.Trans., 2005，33:119-123.

[11]Strous M, Fuerst JA , Kramer EHM, et al . Missing lithotroph identified as new planctomycete[J].Nature ,1999 , 400(6743):446-449.

[12]Schmid M. Molecular evidence for genus level diversity of bacteria capable of catalyzing anaerobic ammonium oxidation[J].Syst Appl Microbiol, 2000,23(1):93-106.

[13]Egli K. Enrichment and characterization of an anammox bacterium from a rotating biological contactor treating ammonium-rich leachate[J].Arch Microbiol, 2001,175:198-207.

[14]Third KA, Sliekers AO, Kuenen JG, et al .The CANON System (Completely Autotrophic Nitrogen-removal Over Nitrite) under Ammonium Limitation: Interaction and Competition between Three Groups of Bacteria[J].System. Appl. Microbiol, 2001，24(4):588-596.

[15]Egli K, et al. Microbial composition and structure of a rotating biological contactor biofilm treating ammonium-rich wastewater without organic carbon[J].Microb Ecol, 2003，45:419-432.

[16]董远湘，李小明，尹疆，杨麒，钟琼.溶解氧对OLAND 生物膜反应器硝化性能的影响及其微生物种群动态研究[J].环境污染与防治，2005，27（8）:561-564.

[17]张丹，刘耀平，徐慧，张颖，陈冠雄.OLAND 生物脱氮系统中硝化菌群16S rDNA 的DGGE 分析[J].生物技术，2003，13（5）:1-3.