金属螯合亲和层析技术及其应用

李淑娟

摘要:固定化金属螯合亲和层析是一种有效的生物分子分离纯化技术,它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点。因此,其在蛋白质纯化、复性和空间定位以及酶的固定化和金属离子清除等方面具有广泛的应用。

关键词:固定化金属螯合亲和层析;纯化;应用

固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromato-graphy,IMAC)是一种亲和纯化技术,它是由 Porath于1975年首次提出并用于吸附牛血清蛋白[1],至今用IMAC已成功分离纯化出数百种生物大分子。该法是基于蛋白质表面的一些氨基酸残基与固定化金属离子的亲和力不同而对蛋白质进行分离纯化。它因配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点而被广泛应用。随着研究的进一步深入,IMAC的新应用也不断地被发现。

1金属螯合亲和层析作用原理

固定化金属螯合亲和层析基于蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子的亲和力不同对蛋白质进行分离。过渡态金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合,金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点,在溶液中被水分子或阴离子占据。当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时,氨基酸残基的供电原子将取代与金属离子结合的水分子或阴离子,与金属离子形成复合物,从而使蛋白质分子结合在固相介质表面。氨基酸中的α-氨基和α-羧基,以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原子都能参与螯合反应,由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同,因而与金属配基的亲和力大小不同,从而可选择性地加以分离纯化[2]。

2金属螯合亲和层析技术的应用

2.1金属螯合亲和层析用于生物分离纯化

IMAC在生物分子纯化方面具有很多优点:(1)结合力强,蛋白结合容量大,可用于工业生产,如采用IMAC吸附介质的扩张床吸附(EBA)技术可从哺乳动物细胞培养粗提物中一步分离纯化溶解性目标蛋白;(2)洗脱条件温和,再生后配体恢复完全,一种IMAC树脂可再生几百次而不改变其层析特性;(3)价格便宜;(4)可通过改装各种金属离子,引入目标蛋白质最适宜的金属离子进行不同蛋白质的纯化。鉴于上述特点,IMAC不仅适用于某些蛋白质、酶、氨基酸及肽的分离纯化,也适用于可逆螯合金属离子的核苷酸、激素、抗体等物质的分离和纯化。

目前,基因工程重组蛋白纯化技术已经成熟,常通过DNA重组技术对蛋白进行标记,该方法在重组蛋白质表达过程中巧妙地将标签(常为6×His尾巴)直接连接到蛋白质的N-末端或C-末端,这种基因工程蛋白与裂解液中的其他蛋白质相比,对金属离子有更高的特异性,在分离纯化后再用化学法或酶法将尾巴切掉。这种方法目前已经成为基因工程下游技术中对融合蛋白纯化最常用的方法。国外公司已推出商品化试剂盒,美国Qiagen公司提供的QIAexpress系统就是较为经典的一种。该系统利用的pQE系列载体不仅有6个His编码序列还含有强启动子和多克隆位点等组成,可将目的基因在宿主细胞中高效表达。表达后的产物可直接用金属螯合亲和层析进行分离,有时可实现一步纯化。金属螯合亲和层析过程既可以在常规的非变性条件下进行纯化,还可以用于变性条件下(6mol/L盐酸胍或8 mol/L尿素)纯化,这对以包涵体形式存在的重组蛋白尤为有利。

2.2金属螯合亲和层析用于蛋白质的复性

在基因工程技术中,表达的重组蛋白多以包涵体形式存在,蛋白质经常会错误折叠而损失活性,这一难题长久以来都没有得到很好的解决。高浓度的变性剂可以溶解包涵体,然后控制变性剂除去的速度,有时需要添加适当的氧化/还原试剂,蛋白质可以逐步折叠复性。通常使用的复性方法有三种,分别是稀释复性,透析复性和层析复性。其中稀释复性和透析复性过程中会有大量无活性蛋白质聚集体形成,而金属螯合亲和层析复性中,蛋白质能可逆吸附在固相介质上,可避免伸展的多肽分子之间形成聚集体。在高浓度变性剂存在的情况下,组氨酸尾仍旧具有吸附在金属螯合亲和层析介质上的能力,所以可在IMAC介质上同时实现复性与纯化[3]。蛋白质吸附在IMAC介质上后,先逐步降低变性剂的浓度,使蛋白质折叠,然后提高咪唑浓度把折叠后的蛋白质洗脱出来。对于TNF蛋白,使用IMAC 获得了90%的复性收率[4]。

2.3金属螯合亲和层析用于蛋白质的分析

金属螯合亲和层析可用于蛋白质的分析鉴定。Jiang等通过金属螯合亲和层析结合金属离子亲和毛细管电泳技术(IMACE)对糖基化导致α-胰凝乳蛋白酶结构变化进行了研究,证明糖基化作用产生两个截然不同的蛋白质,他们对金属离子的亲和性完全相反[5]。

IMAC还可用于磷酸化蛋白分析。蛋白质的磷酸化和去磷酸化是生命体代谢调控的重要机制,已发现IMAC能鉴定磷酸化的蛋白,尤其是Fe3-IMAC已被用来选择性纯化和浓缩磷酸化的蛋白和多肽[6]。

IMAC与重组技术相结合可以使带六聚组氨酸的蛋白质固定在基质上,从而为研究蛋白质的相互作用开辟了新的途径。Celia等[7]用Ni2+负载的金属螯合脂质定向膜捕获组氨酸标记的MHC分子,再通过表面等离子体共振技术(Surface pasmon resonance)考察它们对T细胞受体的结合。锚定蛋白质的NTA/组氨酸标记体系也可被用来通过原子力显微镜测量受体-配体在单分子水平上的结合力[8]。

2.4金属螯合亲和层析技术在其他领域的应用

过渡态金属离子和蛋白质结合的特性也成功应用在蛋白质芯片领域。Zhu等[9]提到了将带有6个组氨酸的蛋白质固定于镀镍的玻璃板上,得到了比常规醛处理表面更高质量的蛋白质芯片。在酵母蛋白质组学研究中,通过克隆5800个开放阅读框,相应的蛋白质纯化后固定于镀镍板上可以筛选能与磷脂相互作用的蛋白质。使用这种技术鉴定了许多新的可与磷脂相互作用的蛋白质。

在固定化酶研究方面,受IMAC的启发,蛋白质的某些结构域可以“位点特异”的固定在固相载体表面,比随机位点固定增加了被固定蛋白质的稳定性并较好的保持了其空间结构,比如固定化酶时可提高酶的半寿期,多次重复使用酶活力亦无明显损失[10]。

综上所述,金属螯合亲和层析是一种重要的生物大分子分离纯化技术,IMAC的应用将不仅局限于蛋白质的分离纯化,其原理还将在蛋白质芯片、生物分子间相互作用、蛋白质结构研究、蛋白质的电化学检测等方面得到应用,从而带动相关领域研究的不断发展。

参考文献:

[1]Porath J, Carlsson J, Olsson I, et al. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation [J]. Nature, 1975, 258(5536): 598-599.

[2]Vijayalakshmi M A. Pseudobiospecific ligand affinity chromatography [J]. Trends in Biotechnology, 1989, 7(3): 71-76.

[3]Hutchinson M H, Chase H A. Adsorptive refolding of histidine-tagged glutathione S-transferase using metal affinity chromatography. Journal of Chromatography A, 2006, 1128(1-2): 125-132.

[4]Xu J, Zhou Q, Ma Z, et al. Study on construction of His6-human TNFβ fusion expression plasmid and single-step purification of its product [J]. Pharmaceutical Biotechnology, 2000, 7: 1-5.

[5]Jiang K Y, Pitiot O, Anissimova M, et al. Structure-function relationship in glycosylated-chymotrypsin as probed by IMAC and IMACE [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1999, 1433(1-2): 198-209.

[6]Stensballe A, Andersen S, Jensen O N. Characterization of phosphoproteins from electrophoretic gels by nanoscale Fe(III) affinity chromatography with off-line mass spectrometry analysis [J]. Proteomics, 2001, 1(2): 207-222.

[7]Celia H, Wilson-Kubalek E, Milligan R A, et al. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96(10): 5634-5639.

[8]Schmitt L, Ludwig M, Gaub H E, et al. A metal-chelating microscopy tip as a new toolbox for Single -molecule experiments by Atomic Force Microscopy [J]. Biophysical Journal, 2000, 78(6): 3275-3285.

[9]Zhu H, Bilgin M, Bangham R, et al. Global analysis of protein activities using proteome chips [J]. Science, 2001, 293(5537): 2101-2105.

[10]Ordaz E, Garrido-Pertierra A, Gallego M, et al. Covalent and metal-chelate immobilization of a modified 2-haloacid dehalogenase for the enzymatic resolution of optically active chloropropionic acid [J]. Biotechnology Progress, 2000, 16(2): 287-291.