检定液相色谱仪应注意的几个问题

唐宜新

摘要：液相色谱技术作为一种高效的分离分析技术，越来越广泛地应用于质量检验、实验研究和制备分离。已经成为我国计量、科研、生产中不可缺少的高效、快速、高灵敏度的分离分析手段，其中高效液相色谱仪（HPLC）是分析实验室的常用分析仪器之一。近20年来，液相色谱技术发展迅猛，其配置及检测精度越来越高。但是在日常工作中，如果实验人员能注意检定液相色谱仪的一些问题，则会大大延长仪器的使用寿命，并使仪器的性能得到最大限度的发挥。

关键词：液相色谱技术；高效液相色谱仪；检定；气相色谱

中图分类号：O657文献标识码：A文章编号：1009-2374（2009）16-0168-02

高效液相色谱法具有分离速度快，分离效能高，检测灵敏度高，选择性能高的特点，而且液相色谱对样品使用范围广，只要求样品能制成溶液，流动相可选择的范围也很宽，因此现在液相色谱在许多领域得到了广泛的应用。其中高效液相色谱仪是分析实验室的常用分析仪器之一，它担负着食品、劳卫等诸多指标的检测，仪器条件经常变化，色谱柱经常拆卸，因此需要对色谱仪经常检定以发现仪器性能的变化。但从我国目前的实际情况看，不少使用分析仪器的工作者常因为不熟悉仪器的结构原理，不甚了解仪器的技术指标对分析测定结果的影响，而不能将仪器调整到最佳状态，从而直接影响到所测定数据的准确性。因此笔者从高效液相色谱仪的组成与基本原理概述出发，探讨了检定液相色谱仪应注意的几个问题。

一、高效液相色谱仪的组成与原理

高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解析的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分并依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

二、高效液相色谱仪的主要检定项目

对气相色谱仪的检定，应依据国家计量检定规程（JJG 700-1999）《气相色谱仪》，主要检定项目有柱温性能、基线噪音、基线漂移、采集系统、检测器等。

（一）柱温性能、基线噪音、基线漂移的检定

对于工厂中使用的某些液相色谱仪，许多色谱柱温的控制只有恒温操作或者只使用恒温操作，从不使用程序升温控制，此时，可只检定恒温的控温精度和稳定性，对程序升温控制的重复性指标可暂不检定。某些气相色谱仪只承担气体样品的分析任务，且只使用低柱温，有的甚至在室温下操作，此时，检定柱温时，只能在其使用的色谱柱温度或者低于老化温度的状态下测定柱温的控温精度和稳定性，以及基线噪音和基线漂移等指标。否则，柱系统内长期滞留的重组分或杂质将会随温度的升高而流出，这将会给基线的稳定带来极大的影响，甚至会造成低温固定相的流失或失效。某些承担组成复杂的样品分析的气相色谱仪，配置有多色谱柱、多切换阀的多维色谱分析系统，而且，所配置的数据处理程序和柱切换程序都是专用的。由于柱系统连接复杂，拆换色谱柱困难，且生产控制分析要求不许轻易更改程序和拆换色谱柱，所以，只能在其使用的柱温条件下检定柱温的控温精度等指标。

（二）色谱数据采集系统的检定

在检测过程中，色谱峰面积的记录一般由原色谱仪所配用的记录仪、积分仪或色谱数据工作站完成，然后根据所采集的色谱图或峰面积数据对基线噪音、基线漂移、检测器的灵敏度或检测限等指标进行计算。在实际工作中发现，由于积分仪和色谱数据工作站的制造厂家、型号的不同，所得到的峰面积也有所差别，由此计算的检测器灵敏度或检测限的差别也较大，有的甚至相差几倍或十几倍。为此，我们采用了不同的积分仪和色谱数据工作站对同一台色谱仪的同一信号进行了采集，并进行了部分数据比较，结果发现所采集的峰积分面积的大小差别较大。试验表明，HP3392积分仪积分峰面积是C-R6A积分仪积分峰面积的7.95倍（约8倍）；SP4290M积分仪积分峰面积是C－R6A积分仪积分峰面积的2倍。所以，在使用数据处理系统时，应特别注意不同的色谱数据处理系统的积分峰面积的差别，并在计算时加以校正。

（三）检测器的检定

检测器的种类很多，应根据所测物质的特性，选择适当的检测器。在高效液相色谱仪中使用最广泛的为紫外吸收检测器。它分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测器三种。固定波长紫外吸收检测器仅由低压汞灯提供固定波长254nm或280nm的紫外光。可变波长紫外吸收检测器（UVD），由氘灯和钨灯作为光源分别提供紫外光和可见光。由于可选择的波长范围很大，既提高了检测器的选择性，又可选用组分的高灵敏吸收波长进行测定，从而提高了检测的灵敏度。二极管阵列检测器（PDAD）是后来发展起来的一种新型紫外吸收检测器，其可获得吸收度随时间与波长的变化的三维空间的立体色谱图，用于被测组分的定性分析和定量测定。蒸发激光散射检测器（ELSD）与紫外吸收检测器相比较，它消除了溶剂的干扰和由于温度变化引起的基线漂移。值得注意的是，实验完毕冲洗色谱柱时，首先要关掉检测器，目的是为了节约光源，保证灯的有效使用，此外，尽量断开色谱柱与检测器的连接，防止污染检测池。

三、高效液相色谱仪检定应注意的问题

用于工业应用的液相色谱仪大部分项目可按规程要求检定，但在检定检测限这一项技术指标时，常遇到一些困难。比如用于白酒分析的液相色谱仪的检测器是氢火焰离子化（FID）检测器，色谱柱主要是DNP-TW填充柱或毛细管柱，规程中规定用标准色谱柱和浓度为100 mg/L的正十六烷-异辛烷标准溶进行检定，尽管我们把色谱仪的各种气体流速、柱箱温度、汽化室温度、检测室温度、仪器衰减等条件一一考虑进去，也不容易得到理想的色谱图，即使得到符合要求的色谱图，也花去很多时间，影响企业使用。遇到的问题与检定方法如下：（1）峰面积重复性差。由于进样阀漏液或加样针不到位会影响到峰面积的重复性。检定方法：进样阀漏液应更换进样阀垫圈：并且保证加样针插到底，注射样品溶液后需快速、平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态，以保证进样量的准确。（2）主峰不佳或峰分叉。长期使用后的色谱柱，由于有杂质进入，会使色谱柱入口处的固定相“板结”并在流动相所产生的高压作用下，形成柱头的塌陷，色谱柱被污染。检定方法：先用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇：异丙醇冲洗柱子，再用甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后甲醇冲洗正向柱子30min以上。

总之，液相色谱仪检定过程中，每项检定项目的检定结果独立给出，因此，进行检定结果来源分析及其评定时要针对每项进行。其中仪器型号不同、所使用计量器具不同，其评定结果也不同，应根据实际情况进行分析评定。比如当仪器性能发生变化时，用不同的色谱柱、不同的标准品分别检定仪器，判定色谱柱和检测器性能的改变，从而找出引起仪器性能变化的根本原因。

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