阿维菌素结晶工艺中的杂质分析

于洪波　龙　燕

摘要：目的：考察不同结晶溶剂对杂质的去除效果。方法：冷却结晶方法。结果考察了阿维菌素粗粉在甲醇、乙醇、正丁醇和丙酮中的重结晶，甲醇和正丁醇对杂质的去除效果更好；乙醇与丙酮结晶效果相当，但对杂质去除的选择性不同，丙酮对B2a和A2b的去除更好一些，而乙醇对A2a、B1b、A1b和A1a的去除效果更好。

关键词：阿维菌素结晶B1a杂质分析

0引言

阿维菌素是十六元大环内酯类抗生素，具有很强的杀虫活性，是一种良好的杀螨虫、昆虫和寄生虫的药物，可以用于人、畜和农作物。作为杀虫剂，阿维菌素具有高效性和广谱性，它可以同时驱杀几乎所有的线虫类、昆虫类和螨虫类寄生虫，且一次用药能达到80％～100％的驱净率。阿维菌素的残毒低，有很好的杀虫选择性，是一种良好的大面积控制害虫的杀虫剂，也是生产多种药物的原料。阿维菌素包括八个组分，它的提纯一般是针对B1a组分。阿维菌素是胞内产物，其生产工艺包括发酵、浸提、浓缩结晶和重结晶提纯。其中结晶是阿维菌素纯化工艺的关键，目前工业上需多次结晶才可得到较好的产品。文献中已有对阿维菌素结晶工艺的研究报道，但主要是从结晶的宏观条件和设备尺度上开展的，由于阿维菌素一次结晶中杂质含量较高，成分复杂，因而研究结晶中的杂质成分以及结晶对不同杂质的去除状况，对阿维菌素的纯化工艺研究有重要意义。

1材料方法

材料阿维菌素结晶粗粉(工业级)和阿维菌素精粉(含B1a：93.62％，甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮均为分析纯。)阿维菌素一次粗粉的重结晶选用冷却结晶方法，将阿维菌素粗粉重结晶三次，比较各次结晶的纯度及杂质的去除状况。乙醇为结晶溶剂，按照程序降温方法冷却结晶；结晶过程中搅拌速度：150r/min，降温区间为85℃～22℃，晶体纯度采用HPLC分析，由面积归一化法定量。

阿维菌素粗粉重结晶一次，取结晶母液采用HPLC分析成分。HPLC仪器HPLC条件流动相为甲醇∶水(85∶15)，流速1ml/min，进样量10μL，检测波长245nm，柱温35℃。ESIMSMS条件：离子源喷射电压35kV，毛细管温度275℃，夹套气(N2)，流速35Arbitary Units，检测方式为正离子检测。

结晶溶剂对杂质的去除效果:以甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮作结晶溶剂按缓慢降温的方式进行冷却结晶，考察不同结晶溶剂对杂质的去除效果。结晶过程中搅拌速度150r/min，降温区间：甲醇结晶55℃～21℃，丙酮结晶50℃～21℃，正丁醇结晶：65℃～21℃。晶体纯度采用HPLC分析，由面积归一化法定量。

2数据分析与讨论

2.1阿维菌素粗粉的重结晶以乙醇作为结晶溶剂对阿维菌素粗粉进行重结晶，HPLC分析给出粗粉、一次重结晶、二次重结晶和三次重结晶所得晶体中B1a的纯度分别为72.65％、92.56％、94.48％和95.57％。B1a组分的保留时间为17.745min，由标准品的HPLC对照得到。结晶对某些保留时间组分的去除效果较好，例如对保留时间在09.446和21.686min组分，一次重结晶基本可以去尽；另一些组分(保留时间在9.401、14.209和24.387min的组分)则通过多次重结晶亦难去除，导致多次重结晶都难以得到纯度较高的阿维菌素产品。深入研究阿维菌素的结晶，需对阿维菌素粗粉中的其他成分进行分析。

针对阿维菌素结晶中的杂质分析对阿维菌素粗粉重结晶所得的结晶母液进行分析，阿维菌素重结晶各组分HPLC分析从液相色谱共分离出10个谱峰，DAD检测发现7个含量较高的组分在245nm处都有紫外最大吸收，推测其主体结构相同，均是阿维菌素类物质。对含量较高的7个杂质进行ESIMSMS分析得到各组分的分子离子峰和主要的碎片离子峰。各组分的分子量是通过加合离子［M+Na］+的质量数来确定的，由分子量可以确定保留时间在12.446、14.209和24.337min的峰为A2a、B1b、A1a组分；保留时间在9.401和10.384min的峰可能为A2b或B2a；保留时间在17.745和21.686min的可能为A1b或B1a。这两组组分的区别不能单纯通过分子量来确定，可以结合组分的极性分析来解决：A、B组分的差别在于R1位置分别是H和CH3，所以A组分。阿维菌素粗粉中B1a和主要杂质的紫外光谱图的极性小于B组分。反相色谱分析时，极性越大的保留时间越小，所以，保留时间为B组分。

不同结晶溶剂对杂质的去除效果实验考察甲醇、乙醇、正丁醇和丙酮作结晶溶剂的冷却结晶，不同的溶剂结晶所得晶体中各种成分含量不同。几种常见溶剂结晶的纯度均在93％～46％之间，对杂质的去除效果稍有差别。甲醇和正丁醇的结晶纯度较高，丙酮和乙醇的结晶效果稍差。甲醇结晶可以去尽A2a、A1b，正丁醇结晶基本可以去尽A2b、A2a、A1b，对另外几种杂质的去除效果也较好。但甲醇的毒性较大且挥发性强，可用于结晶的降温区间小，所以一般在可选择的情况下不选择它作为结晶溶剂，正丁醇的结晶纯度比传统的乙醇结晶纯度有较大幅度的提高，并根据阿维菌素在正丁醇中的溶解度情况，在相同的温度区间，正丁醇的一次结晶处理量约是乙醇结晶的两倍，所以正丁醇是一种良好的结晶溶剂，可以有效的进行工业应用。比较乙醇和丙酮结晶对杂质的去除状况。这两种溶剂结晶所得晶体纯度相近，但它们对杂质的去除情况不相同，丙酮对B2a和A2b的去除更好一些；乙醇对A2a、B1b、A1b和A1a的去除效果更好。因此在利用多次结晶才可以得到产品时，可以在不同次数的结晶时使用不同的结晶溶剂，使得在一次结晶时重点除去某些杂质，在重结晶时重点除去另外一些杂质，以便以较少的结晶次数得到纯度较高的晶体，提高结晶效率，节约生产成本。

3结论

利用HPLCESIMSMS的方法定性阿维菌素粗粉中的杂质与阿维菌素(B1a)结构类似的6个组分B1b、A1a、A1b、A2a、A2b和B2a，其中B1b、A1a、A2a和B2a的含量较高，A1a、B1b、B2a是多次重结晶也难以去除的杂质。考察了阿维菌素粗粉在甲醇、乙醇、正丁醇和丙酮中的重结晶，甲醇和正丁醇对杂质的去除效果更好；乙醇与丙酮结晶效果相当，但对杂质去除的选择性不同，丙酮对B2a和A2b的去除更好一些，而乙醇对A2a、B1b、A1b和A1a的去除效果更好。阿维菌素结晶中杂质的分析有利于指导结晶溶剂的选择，例如，可以针对重点需去除的杂质成分使用，不同结晶溶剂的结晶效果比较，结晶溶剂同溶剂的重结晶方法，以减少总的结晶次数，提高结晶效率。

参考文献：

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