春石斛“桃太郎”启动培养的研究
2009-06-20时晶晶李青
时晶晶 李 青
摘要：本文对春石斛丛生芽繁殖途径的启动培养进行了研究。结果表明：假鳞茎作为外植体，最佳灭菌方法是：75%酒精进行表面灭菌30s，无菌水冲洗1~2次，再用0.1%升汞浸泡6min，最后用无菌水冲洗5～6次；理想的启动培养基是：MS+BA 1.0ml/L+KT 0.5ml/L+NAA 0.1ml/L，启动培养效果最好；外植体的取材时间应选在11月，侧芽萌发所用时间较短，在8～10天之间；褐化现象不严重，可通过连续转接得以缓解。
关键词：春石斛；丛生芽；组织培养
春石斛是兰科（Orchidaceae）石斛属的一类气生兰。其花姿优雅、花色鲜艳、花期较长，被誉为“四大洋兰之一”，被许多花卉生产企业看作是未来的“洋兰之星”，发展前景非常好。目前生产上多采用茎段或高芽扦插的方法进行繁殖，增殖率低，苗不一致，很难达到商品化要求[1]。故春石斛组织培养技术的研究非常必要。
目前，春石斛无菌体系的建立主要是无菌播种[2]、诱导原球茎[3，4]和诱导丛生芽[5-7]3个途径。春石斛是复茎性兰花，腋芽来源广泛，再生能力强，可利用带侧芽茎段为外植体建立再生体系。本文就丛生芽繁殖途径的启动培养进行初步研究，为春石斛的生产提供科学依据。
1 材料与方法
1.1实验材料
以春石斛品种‘桃太郎（Den.Yohkou ‘Peach boy）作为实验材料，本品种属于大花品种，株形高大，约60cm，节长3~4cm。花色为紫红色，唇瓣带白色环，边缘为紫红色，唇盘深紫色，盛开时非常美丽。
1.2方法
1.2.1实验材料预处理。选择生长充实、饱满、黄色的假鳞茎，将叶片去掉，切成3cm左右的小段。先用洗洁精浸泡15min,冲洗泡沫后，流水冲洗1h。
1.2.2外植体的灭菌和接种。在超净工作台里，将茎段先用75%酒精进行表面灭菌30s，无菌水冲洗1~2次，再用0.1%升汞浸泡（过程中不断震荡），最后用无菌水冲洗5~6次（每次2min），种时将茎段两端直接接触升汞的部位切掉，按生长方向插入培养基。
1.2.3培养条件。温度：25±2℃；光照强度：2000~3000Lx；光照时间：12h/d。
1.2.4培养基。以MS培养基作为基本培养基，添加不同浓度的外源激素，蔗糖3%，琼脂0.6%，pH值为5.8。
1.2.5数据统计。污染率（%）=（污染的外植体个数/接种的总数）×100；诱导率（%）=（诱导出芽的个数/未污染外植体的个数）×100。
2 结果与分析
2.1灭菌时间的选择
外植体的灭菌是无菌体系建立的关键，为了能充分灭菌，又不会将植物体杀死，需要选择合适的灭菌时间。本试验设置4min、6min、8min、10min4个灭菌时间，统计污染率和死亡率（见表1）。
由表1可以看出，随着灭菌时间的增加，外植体的污染率下降，灭菌时间为10min的时候，污染率为0。从试验结果看出，该品种带菌情况并不严重，因为材料一直在温室栽培，环境相对洁净。灭菌4min污染率较高。灭菌时间6min和8min比较，未污染且存活的外植体分别为80%和76.7%，虽然6min的污染率较8min高，但死亡率为0，说明升汞对外植体的伤害小，浸泡8min对外植体的伤害较大，可能会影响侧芽的萌发。综合比较，6min灭菌时间最理想。
2.2培养基的选择
本试验以MS为基本培养基，添加细胞分裂素和生长素，设置了8种配方，每配方接种30瓶，重复5次。统计侧芽萌发时间和50天的苗高（见表2）。
①:1/2MS+BA 0.5ml/L+NAA 0.1ml/L;
②:MS+BA 0.5ml/L+NAA 0.1ml/L;
③:MS+BA 1.0ml/L+NAA 0.1ml/L;
④:MS+BA 2.0ml/L+NAA 0.1ml/L;
⑤:MS+KT 0.5ml/L+NAA 0.1ml/L;
⑥:MS+KT 1.0ml/L+NAA 0.1ml/L;
⑦:MS+KT 2.0ml/L+NAA 0.1ml/L;
⑧:MS+BA 1.0ml/L+KT 0.5ml/L+NAA 0.1ml/L。
尽管⑥和⑦号培养基的平均苗高远大于其他配方，增殖系数也较为理想，但是苗的生长状况不好，叶片过长，且有些苗生长畸形，并不能被继代培养所用；综合各个指标，⑧号培养基的苗生长状况最好，增殖系数也理想，故被选作启动培养基。
2.3外植体取材时间的比较
分别在6月和11月取材，0.1%升汞灭菌6min，接种于⑧号培养基。6月外植体侧芽萌发时间在11~13天间，而11份外植体侧芽萌发时间在8~10天间，且苗的长势较6月接种的好（见表3）。故11月取外植体明显好于6月。这可能是与春石斛生态习性有关。春石斛从春季生长开始，到夏季末终止叶形成前，假鳞茎一直在增高。终止叶形成后，假鳞茎开始增粗，直到开花前，假鳞茎内的营养成分大量积累，故在这期间取材作为外植体比较理想。
2.4不同外植体材料启动培养的结果比较
本试验分别用假鳞茎的带芽茎段、叶片和根段作外植体，比较不同材料对丛生芽的诱导结果。将3种外植体分别接种在MS+BA 1.0ml/L+NAA 0.1ml/L上，50天时统计诱导率及诱导状况（见表4）。
由表4可知，诱导丛生芽的最佳外植体是茎段侧芽，诱导率可以达到91.7%，但培养初期，丛生芽增殖并不显著；叶片和根段作为外植体无法诱导出丛生芽，且在培养过程中，逐渐褪绿死亡。
3 小结与讨论
丛生芽繁殖是春石斛离体繁殖的主要途径。春石斛品种‘桃太郎带侧芽的假鳞茎段作为外植体，最佳灭菌方法是：75%酒精进行表面灭菌30s，无菌水冲洗1~2次，再用0.1%升汞浸泡6min，最后用无菌水冲洗5~6次；理想的启动培养基是：MS+BA 1.0ml/L+KT 0.5ml/L+NAA 0.1ml/L；外植体的取材时间选在11月，侧芽萌发所用时间较短，在8～10天之间。
兰花类组织培养普遍存在褐化的问题，本试验中并不明显。侧芽萌发后将其切下，接入新的培养基，有几瓶存在培养基颜色发红的现象，但并不严重，可以通过及时更换培养基缓解，也可加入少量活性炭。但是继代过程中是否会出现褐化现象，有待进一步观察研究。本试验发现春石斛的增殖系数并不大（最大才2.40），继代过程中如何提高增殖系数有待进一步研究。
（收稿:2008-12-20）
参考文献：
1.中国林业科学研究院花卉研究与开发中心. 石斛兰—资源的生产与应用[M] 北京：中国林业出版社，2007
2.赵天榜，陈志秀，陈占宽等.石斛组织培养与栽培技术的研究.河南农业大学学报，1994，28（2）：128～130
3.叶秀粦.石斛兰组织培养和细胞学观察.园艺学报，1995，22（1）：83～87
4.钟士传.植物激素对石斛兰组织培养效果的影响.安徽农业科学，2005，33（4）：621～649
5.孙廷，杨玉珍，胡如善，孙天渊.金钗石斛的组织培养的快繁技术.西北农业学报，2004，13（4）：13～16
6.胡如善，孙廷，杨玉珍.霍山石斛的离体培养研究.江苏农业科学，2005，（4）：72～76
7.付玉兰，张志平，姚萍.春石斛组培快繁技术研究.安徽农业科学，2006，34（3）：464～465
