马铃薯茎尖脱毒组织培养技术研究综述

杨小琴 李善才 李增伟 胡晓燕 孙利军

摘要综述了近几年来马铃薯茎尖脱毒技术的研究进展,从马铃薯生产概况及危害马铃薯的主要因素、茎尖剥离发展历史及原理、茎尖脱毒技术要点、影响马铃薯茎尖脱毒效率的因素方面作了概述并对其发展前景进行了展望,以为马铃薯茎尖脱毒技术发展奠定基础。

关键词马铃薯;茎尖;脱毒;组织培养

中图分类号S532文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)22-0085-02

ReasarchReviewOn Virus-freeTechnology ofPotatoStep-tip Tissue Culture

YANG Xiao-qinLI Shan-caiLI Zeng-weiHU Xiao-yanSUN Li-jun

(Yulin Institution of Agricultural Sciences,Yulin Shaanxi 719000)

AbstractIn the paper,the recent studies on step-tip tissue culture of potato were reviewed. The respects about potato production situation,factors of potato production,historical development, theory and outline of virus-free on step-tip,and influencing factors on virus-free on step-tip tissue culture were summaried.Then the development prospect was presented so as to lay a foundation for the development of potato step-tip virus-free tissue culture.

Key wordspotato;step-tip;virus-free;tissue culture

马铃薯栽培分布较广,世界上共有148个国家栽培,主要分布在欧洲和亚洲。据联合国粮农组织资料统计,全世界现有马铃薯栽培面积为1 838.1万hm2,总产量29 511.8万t,平均单产16t/hm2[1,2]。我国是马铃薯种植大国,种植总面积逾460万hm2,是世界上最大的马铃薯生产国[3,4]。预计到2010年,我国马铃薯种植面积将达到600万hm2,届时我国马铃薯产量将达到1.8亿t。近年来,随着我国农业产业结构调整和种薯、商品薯、加工企业市场的发展,优质马铃薯加工产品供不应求,加工用薯比例大幅度增加,马铃薯栽培正成为种植业结构调整和农民增收的一项战略选择,而马铃薯种植逐步走向规模化、标准化、区域化[5]。

但在马铃薯连年的栽培过程中,由于病毒或类病毒的侵染和积累,造成马铃薯质量退化和产量下降,因而栽培无病毒植株具有重要的生产价值。解决马铃薯退化,获得无病毒植株的途径有自然选择、物理学方法、化学药剂处理、生物学方法等。其中最行之有效的方法便是生物学方法中的茎尖脱毒。该文就马铃薯的茎尖脱毒及影响其脱毒效果的技术措施进行了综述,以期为生产优质脱毒苗,保证种薯源头质量提供参考。

1马铃薯产业现状及危害其生产的主要因素

栽培种的马铃薯(Solanum tuberosum L.,2n=48)是双子叶种子植物,属茄科(Solanaceae)茄属(Solanum)一年生喜凉草本植物[6]。又名洋芋、土豆,原产南美洲,在我国已有300多年的栽培历史。马铃薯生育期短,产量高,营养丰富,是典型的粮菜两用型作物,是我国四大栽培作物之一。

世界马铃薯面积分布的最大特点是以欧、亚两洲种植为主,两者种植面积占世界马铃薯总面积的78%,其中中国、俄罗斯、乌克兰、印度四大生产国占世界种植面积的1/2[7]。而马铃薯的发源地南美洲种植面积只占世界马铃薯总面积的5%。除整个美洲大陆保持相对稳定外,欧洲的种植面积在持续减少,而亚洲、非洲的种植面积在不断增加。马铃薯在生产上绝大多数是利用块茎进行无性繁殖[4]。国际马铃薯中心(CIP)和国际食品政策中心(IFPRI)合作研究表明,到2020年为止,全世界对马铃薯的需求将有望增长40%,超过水稻、小麦和玉米的增长。特别是亚洲和非洲对马铃薯的需求将增长更快[8]。

马铃薯在栽培过程中,植株逐年变小,叶片皱缩卷曲,叶色浓淡不均,茎杆矮小细弱,块茎变形龟裂,产量逐年下降,这些都表明马铃薯已经发生退化。种薯退化是引起产量降低和商品性状变差的主要原因[9]。据此,科学家从植物生理学、生物化学、栽培技术、栽培环境、种薯贮藏条件、病虫害侵染等方面对马铃薯“退化”进行了深入的研究,研究表明,各种病毒、真菌、细菌等对马铃薯的侵染是导致我国马铃薯单产较低的主要原因[10-12]。

目前,已知的马铃薯侵染病毒约有30种,由于马铃薯育种体系尚不健全,农民自留种现象普遍,致使病毒感染面积占到栽培总面积的80%以上。在我国广大马铃薯产区,危害马铃薯的5种主要病毒为马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯A病毒和Y病毒(PVA,PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV),以及马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)。其中PVY、PLRV是危害最为严重的2类病毒。

2茎尖脱毒技术发展历史及其原理

马铃薯茎尖培养(stem/shoot tip culture),又叫分生组织培养(meristem culture),是包括马铃薯在内的许多植物脱除病毒的重要手段。

1943年,P.R White将系统感染了奥古巴花叶病毒的番茄根(长120mm)等分为12段,分别接种到心叶烟上,36h后,接种近生长点的2段在心叶烟上未产生病斑,而接种在远生长点的10个切段均出现病斑,且离生长点愈远病斑愈多。B.Kassanis(1957)、Crowley & Hanson(1960)等进一步证明,细胞分裂与病毒复制之间存在着竞争关系,在活跃的茎尖分生组织中,正常核蛋白合成占优势,病毒粒子得不到复制的营养而受到抑制[13]。

1955年,法国人G.Morel和C.Martin通过茎尖培养,获得了无PVX、PVA和PVY的马铃薯植株,此后,这项技术快速发展,为解决马铃薯病毒危害提供了有效途径。目前,世界上几乎所有的马铃薯生产国都采用这一技术。

我国在20世纪70年代初由吉林农业大学、辽宁省农科院和黑龙江省克山农业科学研究所对茎尖组织培养进行了初步试验,自1974年开始,中国科学院植物研究所、微生物研究所、动物研究所、黑龙江省克山农业科学研究所、内蒙古乌兰察布盟农科所以及内蒙古大学等单位协作,开展了茎尖组织无病种薯的技术和应用研究,1976年内蒙古建立了我国第1个马铃薯脱毒原种场,从而开始了我国无病毒种薯的生产时代[4]。

茎尖培养脱毒是利用病毒在植物体内分布的不均匀性,即根尖和芽尖的分生组织含病毒量少或不含病毒进行培养。导致这一现象的原因至今还未明确,主要包括:①病毒的复制须利用寄主的代谢过程,无法与分生组织旺盛的代谢活动竞争;②分生组织缺乏真正的维管组织,大多数病毒在植株内通过韧皮部进行迁移,或在细胞间通过胞间连丝传输[14]。病毒在细胞与细胞间的移动速度较慢,在快速分裂的组织中病毒浓度高峰被推迟[15-17];③分生组织的生长素浓度通常很高,可能影响病毒的复制。也有一些病毒如PVX,在人们所有观察的分生组织中都有存在,但通过茎尖培养依然可以脱去PVX,这说明PVX在培养过程中是可以被脱去的,其机制可能是分离组织所产生的某种钝化因子或培养基中某种成分对病毒的效应所致,也可能是分离组织与培养基接触的结果。病毒复制时,需要某些作用于靠近分生组织圆锥体细胞的酶类,当茎尖被剥成很小时,它们的生长过程暂时被打乱了,病毒复制时所需要的酶失去作用,从而中断了传染性病毒的复制[18]。一般认为,类病毒是无法脱除的,但经过重复茎尖培养结合热处理也可脱去PSTVd,只是脱毒率太低,具体机制尚待研究[19]。

3马铃薯茎尖脱毒技术

马铃薯茎尖分生组织培养属植物组织培养中的体细胞培养[20],茎尖脱毒是多数植物汰除病毒病的方法,其主要技术步骤如下[21,22]:首先将带毒薯在室内催芽、消毒处理;然后在超净工作台无菌条件下,切取0.1~0.3mm、带1~2个叶原基的茎尖分生组织,移植于装有MS培养基的试管中培养,大约4个月后,茎尖分生组织长成试管苗;试管苗经过病毒检测,从大量植株中鉴定出确实不带病毒的脱毒苗;再经过切段快繁、脱毒微型薯(原原种)的诱导,原种、良种繁育,直至大田生产商品薯[4,23,24]。将茎尖脱毒技术和高效留种技术相结合,并建立科学合理的良种繁育体系,是大幅度提高马铃薯产量和质量的可靠保证。

马铃薯在脱毒过程中去除了主要病毒,恢复了原品种的特征特性,达到了复壮的目的。同时也将其所感染的真菌和细菌病原物一并脱除,而且脱毒薯在一定时期内,没有病毒、细菌和真菌病害,其生活力特别旺盛。

4影响马铃薯茎尖脱毒效率的因素

4.1茎尖大小和病毒种类

病毒浓度在茎尖附近呈递减分布,因此茎尖越小脱毒效果越理想,但茎尖就越难成活。此外,不同病毒在茎尖分布不同。一般来说,各种病毒的脱除从易到难顺序为:PLRV>PVA>PVY>马铃薯奥古巴花叶病毒(PAMV)>PVM>PVX>PXS>PSTVd。但此顺序也会因品种、培养条件、病毒株系不同等而有所变化[25-28]。

4.2化学制剂

化学治疗剂能提高培养基去除病毒的能力。如在培养基中加入碱性孔雀绿、2,4-D和硫尿嘧啶等病毒抑制剂,能显著提高无病毒植株的数量。一些研究学者在甘薯茎尖培养脱毒研究中发现,培养基中添加适量的TS制剂(一种病毒钝化剂)虽稍微抑制了茎尖的发育,但可以提高脱毒率,但TS制剂对马铃薯茎尖培养脱毒是否有相同的效果,仍值得研究和探讨[29]。

4.3高温处理

为提高脱毒效果,茎尖培养还可与热处理结合使用,其方法是脱毒植株长到3cm左右时,进行变温处理(白天37℃处理12h,晚上25℃处理12h)4周。在一定的温度范围内进行热处理,寄主组织很少受伤害甚至不受伤害,而植物组织中很多病毒却可被部分地或完全钝化。如高温预处理可以显著提高对PAMV、PVX和PVS的去除[30,31]。

4.4影响病毒去除的其他因素

去除病毒的难易还受其他病毒的干扰:只有PVX存在时,从茎尖培养产生的42株植物中,有34株是无这种病毒的;但当植物受PVX病毒及其他病毒复合侵染时,从茎尖培养产生的34株植物中只有2株是无PVX病毒的,这说明病毒之间存在着干扰作用[27]。此外,病毒去除还与培养条件有密切的关系。通常,接种的茎尖放在培养室内培养,温度可在15~30℃范围内,以20℃为宜,光照1 000~3 000Lx,以日光灯为光源,每天照光16h。

5展望

马铃薯茎尖培养脱毒是目前脱除病毒最常用、效果最好的方法,在脱毒过程中,影响茎尖成活、成苗及脱毒效率的因素诸多,尤其是茎尖培养过程中培养基中所加的植物生长调节剂的绝对浓度和配比及培养基的状态等研究上存在着较大分歧。脱毒技术体系中,有关热处理的方法、茎尖的大小及病毒脱除的难易程度等均有不同的说法和做法。因此,对影响茎尖成活、成苗及脱毒过程中的诸多影响因素进行比较、系统地研究,具有一定的实用价值和现实意义,它可以为马铃薯脱毒技术人员提供一条切实可行、高效率的脱毒途径。

6参考文献

[1] 屈冬玉,谢开云,金黎平,等.中国马铃薯产业现状与趋势[C]//中国马铃薯学术研讨会与第五届马铃薯大会论文集,2004:230-239.

[2] 裴荣信.马铃薯小整薯播种的理论与实践[J].马铃薯杂志,1983(3):49-54.

[3] 程天庆.马铃薯脱毒高产技术问答[M].北京:科学普及出版社,1994.

[4] 黑龙江省农业科学院马铃薯研究所.中国马铃薯栽培学[M].北京:中国农业出版社,1994.

[5] 李文刚,宁怀玉.马铃薯脱毒微型种薯生产及其繁育推广体系——铃田模式[J].中国马铃薯,2002,16(2):92-94.

[6] 张志铭.马铃薯病害及其防治[M].石家庄:河北科学技术出版社,1992.

[7] 裴荣信.马铃薯茎尖脱毒技术的改进[J].石家庄马铃薯杂志,1988(2):223-227.

[8] HUBERT Z.Global trend indemand,production and research[C].Procee-dings of the Fifth World Potato Congress,2004:6-8.

[9] ALLAND R H.Principess of Plant Breeding[J].New York,1986(14):25-30.

[10] 郭健,夏同会.组织培养技术在马铃薯良种繁育上的应用[J].马铃薯杂志,1988(2):100-101.

[11] 屈冬玉,金黎平,谢开云,等.中国马铃薯生产现状、问题和趋势[C]//马铃薯专业委员会2001年年会论文集,2001:1-8.

[12] 中国农业科学院蔬菜研究所.中国蔬菜栽培学[M].北京:农业出版社,1987.

[13] 汤芳德,刘耀宗.马铃薯大全[M].北京:海洋出版社,1992.

[14] SALAZAR L F.马铃薯病毒及其防治[M].北京:中国农业科技出版社,2001.

[15] HOSAIN M J.Combination of heat treatment and meristem culture for producingvirus-freepotato[J].Bangladesh Journal of Agricultural Resea-rch(Bangladesh),1992,17(2):147-150.

[16] 沈清景,叶贻勋,凌永胜.马铃薯脱毒原原种商产快营技术研究[J].福建农业学报,2000,15(4):51-56.

[17] 张希近.脱毒马铃薯种苗及原原种生产技术[J].杂粮作物,2000,20(3):22-24.

[18] ERCOLANO MR,CARPUTO D,STRAFACE S,et al.Evaluation of potato genotypes suitable for the pedoclimatic conditions of Campania Solanum tuberosum[J].Plant genetics and breeding(Grop husbandry),1997,31(3):17-28.

[19] 张辅达,孙宪昀.马铃薯茎尖培养脱毒研究进展[J].中国马铃薯,2004,18(1):35-38.

[20] MOYER J W,SALAZAR L F.Viruses and Viruslike diseases of sweet potato [M].Plant Disease,1989,73(6):451-455.

[21] 裘维蕃.植物病毒学[M].福州:福建科学技术出版社,2001.

[22] 中国科学院遗传研究所组织培养室三室五组.离体培养马铃薯茎顶端(或腋芽)生长点的初步研究[J].遗传学报,1976,3(1):51-55.

[23] 田波.马铃薯无病毒种薯生产的原理和技术[M].北京:科学出版社,1980.

[24] 屈冬玉.2000年马铃薯专业年委员会学术年会总结[J].中国马铃薯,2000,14(4):249-251.

[25] 马铃薯种薯生产协作组.马铃薯种薯生产的研究I用茎尖培养法生产马铃薯无病毒原种[J].植物学报,1976,18(3):233-238.

[26] 黄楚材,代启益,李春元.茎尖培养马铃薯“双季1号”获得无毒植株的研究[J].马铃薯杂志,1980(1):4-7.

[27] 林长春,李其文.马铃薯茎尖脱毒与种质资源试管保存的研究[J].马铃薯杂志,1989,3(2):73-78.

[28] 林长春,滕丽伟.不同形态和种类培养基对马铃薯茎尖生育的影响[J].马铃薯杂志,1990,4(3):153-154.

[29] 尚佑芬,杨崇良,赵玖华.应用茎尖培养技术防治甘薯病毒病的研究[M].北京:中国农业科技出版,1997.

[30] 刘仪.植物病毒与病毒防治研究[M].北京:中国农业科技出版社,1997.

[31] 陈维伦,陶国清.植物生物技术[M].北京:科学出版社,1987.