我国萝卜分子生物学研究现状与前景展望

王冰林 李媛媛 韩太利

（1.潍坊市农业科学院，山东潍坊，261061；2.潍坊学院生物工程学院）

我国萝卜分子生物学研究现状与前景展望

王冰林1李媛媛2韩太利1

（1.潍坊市农业科学院，山东潍坊，261061；2.潍坊学院生物工程学院）

概述了分子标记、基因克隆、基因定位、常用分子生物学技术体系优化等在萝卜研究中的应用进展，并对现代分子生物学技术在萝卜遗传改良应用中存在的主要问题和应用前景进行了讨论。

萝卜 分子生物学 分子标记 基因克隆 基因定位

萝卜起源于中国，在中国已有2 700多a的栽培历史。我国萝卜种质资源丰富，收集保存的萝卜资源达2 000余份，各生态区域均有适合本地消费习惯和不同生长季节的传统地方品种。萝卜可菜用、生食和加工，主要食用部位为膨大的肉质根，富含多种维生素、矿物质、碳水化合物、粗纤维、木质素、淀粉酶及芥子油等有益成分，具有祛痰、利尿、止泻等药用功效，是我国人们喜爱的营养保健蔬菜之一，在蔬菜栽培和供应中占有重要地位，近年消费量呈明显上升趋势。长期以来，我国已在萝卜品种选育、优质高产配套栽培技术、生理生化、组织培养、病虫害防治等领域取得了显著成绩，但在现代分子生物学研究方面则相对滞后。近年来，随着分子生物学技术在植物研究中的广泛应用，我国在萝卜分子标记技术、基因克隆、基因定位、常用分子生物学技术体系优化等方面取得了一定进展。

1 DNA分子标记技术

DNA分子标记具有数量丰富、遗传稳定、便于操作等特点，并且能对各个发育时期的个体、组织、器官甚至细胞进行检测，既不受环境影响，也不受基因表达与否的限制，所以建立在DNA基础上的分子标记技术已广泛应用于植物遗传育种中。近年来，分子标记技术研究在萝卜种质资源遗传多样性、种子纯度与体细胞杂种鉴定等方面取得较大进展。2004年，孔秋生等[1]利用12个随机引物，对来源于不同国家和地区的有代表性的56份萝卜种质资源遗传多样性进行了RAPD分析，共扩增出109条带，其中多态性带72条，占62.9%。2005年，孔秋生等[2]又利用筛选出的8对引物对56份萝卜种质的亲缘关系进行了AFLP分析，共扩增出327条带，其中多态性带 128条，多态性位点百分率39.1%，表明栽培萝卜种质资源存在较丰富的遗传多样性，为萝卜种质资源的收集、保存、创新和有效利用提供了相关依据。分子标记还应用于萝卜品种纯度鉴定，2005年，任雪松等[3]利用80个随机引物对胭脂萝卜及杂株进行了RAPD分析，发现引物S50可在胭脂萝卜和杂株的RAPD图谱中形成多态性差异，可将其用于胭脂萝卜种子的纯度检测。2007年，赵丽萍等[4]应用SRAP与AFLP两种分子标记方法进行了萝卜品种鉴定分析，供试材料均可被这两种标记准确鉴定。另外，经过改良的AFLP技术——甲基化敏感扩增多态性（MSAP）被用于金属镉胁迫处理后萝卜基因组DNA甲基化程度的变化研究，为从DNA水平上揭示重金属毒害机理与植物对重金属胁迫的反应机制提供了理论依据[5]。

2 基因克隆与异源表达

早在1992年，王燕平等[6]对心里美萝卜抗病毒干扰素诱生剂有效成分dsRNA进行了克隆，并应用cDNA杂交法检测了不同变种萝卜dsRNA的亲缘性。目前，萝卜基因克隆及诱导表达研究主要体现在抗病相关基因上，并通过在大肠杆菌中异源表达进行功能验证。抗菌肽是一类新型的抗菌物质，可以保护植物组织和种子不受真菌侵害。侯路珍等[7]采用RT-PCR方法，从萝卜叶子中克隆到抗菌肽基因AFP，并在大肠杆菌中得以诱导表达，表明该基因在原核表达系统中能够正常表达。2006年，刘金亮等[8]从表现红心病的潍坊萝卜块根上得到一芜菁花叶病毒分离物，通过RT-PCR获得了该分离物的外壳蛋白基因，将该基因克隆到原核表达载体pET-22b（+）中，在大肠杆菌BL21中表达出分子量为38 kD的融合蛋白，Western blotting分析证明该基因在大肠杆菌中得到了正确表达。近年来，还有关于萝卜雄性不育相关基因——细胞色素P450 CYP86MF基因、花粉发育相关基因RsMF2的克隆及其结构特征分析的报道[9～10]。

3 基因定位

萝卜基因定位研究起步较早，但进展较慢。早在1989年，为了确定叶绿体DNA与花粉育性有关的特异片段位置，王虹等[11]利用萝卜细胞质雄性不育系401A及其同核保持系401B为材料研究发现，萝卜叶绿体DNA花粉育性相关的3个差异片段位于rRNA基因所在的叶绿体基因组反向重复区。1997年，熊玉梅等[12]对萝卜叶绿体DNA进行了限制性酶切分析，将Rubisco大亚基基因（rbcL）定位在E11片段上，并构建了ctDNA EcoRⅠ基因文库，为进一步研究rbcL基因的表达和筛选其他目的基因奠定了基础。2008年，张绍松等[13]与德国合作，将野生油萝卜抗甜菜胞囊线虫基因定位于d染色体上，并且发现油萝卜的9条染色体附加到油菜中后，其遗传稳定性因附加的染色体而异，有的能稳定遗传，有的在自交后代中丢失1条或2条。

4 常用分子生物学技术体系优化

PCR以及在PCR基础上发展起来的RAPD、ISSR分子标记和mRNA差异显示反转录PCR（DDRT-PCR）等是常用的分子生物学实验技术，在动植物种质资源遗传多样性分析、基因图谱构建、标记辅助选择和基因差异表达等领域均得到广泛应用。近年来，这些技术在萝卜中也逐渐得以应用并不断优化。张建军等[14]以萝卜基因组DNA为模板进行了RAPD-PCR反应体系优化研究，将正交试验用于条件优化试验以获得优良反应体系。宋贤勇等[15]对影响PCR反应的主要因子——模板DNA、引物、dNTPs和Mg2+浓度进行了优化，建立了适合于萝卜基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系。随机扩增微卫星多态性（RAMP）是一种RAPD和SSR相结合的新型分子标记，龚义勤等[16]对萝卜基因组RAMP分析体系中的Mg2+，dNTPs和引物浓度进行了优化，并对7个萝卜品种的遗传多样性和品种鉴定进行了RAMP标记分析。DDRT-PCR是一种鉴定基因差异表达的常用分析方法，2008年，贾晋等[17]以萝卜幼嫩薹叶及花蕾为试材，探索了快速、高效的RNA提取方法；并以萝卜花蕾为材料，对影响DDRT-PCR体系的5个关键因素进行了优化，得到了重复性好、适用范围较广的mRNA差异显示反应体系。以上分子生物学技术体系的优化为从分子水平上研究萝卜种质资源评价利用、品种鉴定、种子纯度检测、雄性不育遗传机制与分子育种提供了重要的技术支撑。

5 其他

近年来，萝卜分子生物学研究还体现在功能基因表达载体构建、调控序列分析等方面。2004年，马春花等[18]利用基因工程技术构建了含有几丁质酶、1，3-葡聚糖酶和萝卜抗真菌蛋白的三价植物表达载体，并通过农杆菌直接转化法将其转入农杆菌EHA105，获得阳性重组农杆菌工程菌株。萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因（RsPHGPx）编码一个有生理功能的过氧化物酶，为深入了解该基因的表达调控机制，2005年，杨晓东等[19]采用DNA印迹、常规PCR与染色体步行法相结合的方法阐明了RsPHGPx基因的结构及其上游调控序列，这是首个关于植物PHGPx基因结构和上游调控序列的系统报道。

6 存在的问题与研究展望

目前，我国在萝卜分子标记、基因克隆、基因定位等现代分子生物学研究领域已取得了一定进展，但尚处于起步阶段，许多问题还有待于进一步研究和解决。例如，萝卜分子标记技术多限于种质资源遗传多样性、种子纯度与体细胞杂种鉴定等方面，而重要农艺性状分子标记辅助选择研究尚未深入开展，某些技术体系还处于探索阶段；虽然基因克隆与基因定位研究较早，但进展缓慢，基因功能只能通过大肠杆菌异源表达进行验证，而关于萝卜遗传转化体系与功能基因实质性验证等研究还未见报道。

随着现代分子生物学理论与技术在不同物种、不同研究领域的快速发展与广泛运用，今后在萝卜遗传改良和实际应用中可加强以下研究：应用DNA分子标记进行重要性状辅助选择；高密度遗传图谱的构建和重要性状的基因定位；基因工程技术与种质创新利用；基因组研究；常规育种技术和现代生物技术有机结合促进优质、抗性育种研究等。高密度遗传图谱构建和重要性状基因的精确定位，能够促进萝卜分子标记辅助选择育种发展。利用植物基因工程技术，可以打破物种间界线，改良现有萝卜品种和提供优异变异种质，加速优质、高抗萝卜新品种选育。以上研究将提高萝卜遗传育种的目的性、精确性，缩短育种周期，提高育种效率。

[1]孔秋生，李锡香，向长萍，等.萝卜种质资源亲缘关系的RAPD分析[J].植物遗传资源学报，2004，5（2）：156-160.

[2]孔秋生，李锡香，向长萍，等.栽培萝卜种质亲缘关系的AFLP分析[J].中国农业科学，2005，38（5）：1 017-1 023.

[3]任雪松，李成琼，宋洪元，等.胭脂萝卜种子纯度的RAPD检测研究[J].西南农业大学学报：自然科学版，2005，27（6）：837-839.

[4]赵丽萍，柳李旺，龚义勤，等.萝卜品种指纹图谱SRAP与AFLP分析[J].植物研究，2007，27（6）：687-693.

[5]杨金兰，柳李旺，龚义勤，等.镉胁迫下萝卜基因组DNA甲基化敏感扩增多态性分析[J].植物生理与分子生物学学报，2007，33（3）：219-226.

[6]王燕平，陈爱君，张竞，等.心里美萝卜dsRNA的克隆和cDNA杂交法检测不同变种萝卜dsRNA的亲缘性[J].病毒学报，1992，8（4）：364-366.

[7]侯路珍，刘发央，谢小冬.萝卜抗菌肽基因AFP的克隆及其在大肠杆菌中的诱导表达[J].甘肃农业大学学报，2004，39（3）：245-248.

[8]刘金亮，于晓庆，田延平，等.潍坊萝卜中芜菁花叶病毒分离物的分子特性及CP基因的表达[J].园艺学报，2006，33（1）：84-88.

[9]王玲平，曹家树，叶纨芝.萝卜RsCYP86MF基因cDNA全序列克隆及结构特征分析[J].园艺学报，2005，32（1）：127-130.

[10]张涛，曹家树.萝卜花粉发育相关基因RsMF2的分子克隆与特性[J].中国农业科学，2005，4（7）：494-500.

[11]王虹，李继耕，孔繁瑞，等.萝卜叶绿体DNA花粉育性特异片段的定位[J].生物工程学报，1989，5（1）：40-45.

[12]熊玉梅，张西平，张效民，等.萝卜叶绿体rbcL基因定位及ctDNA基因文库的构建[J].武汉大学学报：自然科学版，1997，43（4）：532-535.

[13]张绍松，Peterka H，Budahn H，等.油萝卜抗胞囊线虫基因的染色体定位及其在油菜附加系中的稳定性[J].中国农业科学，2008，41（1）：93-101.

[14]张建军，司龙亭，姜晶.优化萝卜基因组DNA RAPD-PCR反应体系的正交设计法[J].植物生理学通讯，2006，42（2）：293-295.

[15]宋贤勇，柳李旺，龚义勤，等.萝卜基因组DNA RAPD与ISSR-PCR反应体系优化[J].种子，2007，26（2）：1-5.

[16]龚义勤，李培，王明霞，等.萝卜基因组DNA的RAMP-PCR体系优化[J].植物研究，2006，26（1）：93-97.

[17]贾晋，张鲁刚.萝卜DDRT-PCR技术体系的优化[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2008，36（4）：128-134.

[18]马春花，周鹏，王华.几丁质酶、葡聚糖酶与萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因三价表达载体的构建及农杆菌工程菌株的重组[J].西北植物学报，2004，24（4）：570-577.

[19]杨晓东，刘进元.萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因结构及其调控序列分析[J].生物化学与生物物理进展，2005，32（7）：649-655.

Progress and Prospect of Molecular Biology in Radish in China

WANG Binglin1,LI Yuanyuan2,HAN Taili1
(1.Weifang Academy of Agricultural Sciences,Shandong 261061; 2.College of Biological Engineering,Weifang University)

The progress of molecular marker,gene cloning,gene mapping,and the system of molecular biotechnology in radish was reviewed in this paper.Meanwhile,the major problems and outlook about the applications of molecular biotechnology to genetic improvement in radish were discussed.

Radish;Molecular biology;Molecular marker;Gene cloning;Gene mapping

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.08.001

山东省中青年科学家科研奖励基金（2007BSA07009）

王冰林（1972-），男，博士，副研究员，副院长，主要从事蔬菜遗传育种与生物技术研究，电话：0536-2118661，13583610349。E-mail:binglinwang@126.com

2008-11-13