42种药用植物甲醇提取物对番茄灰霉病菌抑菌活性的研究

王学贵 伍智华 沈丽淘 田永清

（1.农药与化学生物学教育部重点试验室，华南农业大学，广州，510642；2.四川农业大学农学院）

WANG Xuegui1,2,WU Zhihua2,SHEN Litao1,TIAN Yongqing1

42种药用植物甲醇提取物对番茄灰霉病菌抑菌活性的研究

王学贵1，2伍智华2沈丽淘2田永清1

（1.农药与化学生物学教育部重点试验室，华南农业大学，广州，510642；2.四川农业大学农学院）

运用菌丝生长速率抑制法测定了42种植物甲醇提取物对番茄灰霉病的抑菌活性。试验结果表明，心籽绞股蓝、海南五针松、水马桑3种植物提取物对番茄灰霉病菌的抑菌作用较好，在5 mg/mL浓度下抑制率分别为83.68%，76.21%，60.88%；并进一步测定心籽绞股蓝、海南五针松及水马桑对番茄灰霉病的毒力，其分别为1.000 mg/mL，3.275 mg/mL及5.050 mg/mL。心籽绞股蓝表现出对番茄灰霉病菌有较好的抑制作用，但其抑菌活性成分还需进一步深入研究。

番茄灰霉病 植物甲醇提取物 心籽绞股蓝 抑菌活性

番茄是世界上最主要的蔬菜作物之一，由于含有丰富的营养成分，在人们日常生活中占有举足轻重的地位。番茄灰霉病是番茄生产过程中的主要病害之一，常造成果实腐烂，一般减产20%～30%，严重的高达50%以上，对番茄生产构成极大威胁[1]。目前，在防治灰霉病上主要选用苯并咪唑类的多菌灵、甲基硫菌灵，二甲酰亚胺类的腐霉利，异菌脲以及N-苯氨基甲酸酯类的乙霉威等药剂。长期单一的使用该类药剂使得番茄灰霉病菌对其产生了严重的抗药性，同时加大剂量防治导致农药残留的问题越来越严重[2～4]。因此，开发高效、低毒、低残留的“环境和谐农药”（environment acceptably/friendly pesticides），有效防治番茄灰霉病已经成为当务之急[5]。

植物源农药由于对人畜安全无毒，对环境安全及对病虫的杀伤特异性强等[6]，已受到社会的广泛关注。科学研究工作者对其进行了大量的研究，如我国曾以大蒜素分子结构为模板衍生合成了乙蒜素，成功开发出“抑菌素401”和“抑菌素402”，用来防治甘薯黑斑病、小麦腥黑穗、棉花苗期病害等[7]；黄乐平等[8]通过对新疆几十种植物抑菌活性的测定，发现了7种植物对黄瓜霜霉病有较好的防效，并进一步对其中的4种植物抑菌活性研究后，复配出抗病增产剂I号、Ⅱ号、Ⅲ号；孟昭礼等[9]经过对银杏抑菌活性十几年的潜心研究，现已通过仿生合成开发出“绿帝乳油”，并已经获得专利。另外，还采用人工模拟技术合成一种农用杀菌剂银泰。Dev U等[10]研究发现，植物芳香成分中的丁子香酚、甲基丁子香酚、柠檬醛、2-苯乙醇等6种化合物对5种种子病原真菌的菌丝生长有强烈的抑制作用，在植物病害防治和检疫中具有潜在的应用价值。

因此，对植物进行杀菌活性筛选，寻找具有高效杀菌活性的特有植物，对探索结构新颖的可直接应用于农业病害防治或进行仿生合成寻找先导化合物，具有重要意义。本研究对42种药用植物甲醇提取物对番茄灰霉病进行了生物测定，为从植物中分离出对番茄灰霉病具有高活性的化合物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

②供试植物材料 除峨眉菝葜采自峨眉山之外，其余41种植物均采自重庆金佛山国家自然保护区。品种如下：蛇足石杉（Thunb.ex Murray）峨眉菝葜、檫木海南五针松岩木瓜Corner）、珍珠莲Oliv.）Corner）、南川木菠萝

③供试溶剂 丙酮（AR级），甲醇（AR级），无菌水。

④供试仪器 DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱，LDZX-50FA立式电热压力蒸汽灭菌器，SPX生化型培养箱，FZ-102型粉碎机，EYELA-1000型浓缩仪，DPH-6123型真空干燥箱，CP224S电子分析天平。

1.2 试验方法

①植物样品前处理与活性物质的提取a.植物样品的干燥与粉碎。将采集的各种样品约500 g自然风干，再利用真空干燥箱干燥，箱内温度为55℃，压力为0.05 Pa，直到植物样品完全干燥为止。用粉碎机进行粉碎，得到60目（孔径0.246 mm）筛的植物样品粉末备用。

b.植物甲醇提取物的提取。采用冷浸法进行提取：称取50 g供试植物干粉装入大型广口瓶 （体积1000 mL）中，然后加入500 mL甲醇进行提取，5 d后滤出浸提液，采用旋转蒸发仪减压浓缩。采用以上方法再重复提取2次，合并所得的甲醇浸膏，称重存储于冰箱中备用[11]。

②植物甲醇提取物的抑菌活性筛选 采用菌丝生长速率抑制法[7]。分别准确称取每种植物甲醇浸膏0.5 g溶解于2 mL丙酮中，然后加无菌水至10 mL，配成50 mg/mL母液，用20 W紫外灯照射30 min备用。配制母液过程中，如果浸膏溶解性不好，可加入2～3滴吐温80进行搅拌，同时辅助超声波处理10 min增加其溶解性，形成均一稳定的药液备用。

用1 mL的移液管取1 mL母液转移到培养皿中（Φ=9.0 cm），然后用10 mL移液管移取9 mL熔融培养基（50～60℃）到培养皿，形成5 mg/mL的含毒培养基，对照为0.2 mL丙酮+0.8 mL无菌水+9 mL培养基，每处理重复3次。最后在冷却培养基表面接种菌饼（Φ=0.5 cm），然后放入28℃恒温培养箱中培养，72 h后采用“十”字交叉法测定菌落直径。

③抑菌活性较好的提取物对番茄灰霉病毒力的测定 每个提取物设置5个浓度梯度处理，其余同②。

④数据处理 计算各处理抑制率。将浓度转化为浓度常用对数，抑制率转化为几率值，建立毒力回归方程（=a+b），求出毒力及95%的置信区间。

抑制率（%）=[（对照菌落扩展直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-0.5×菌饼直径）]×100%。

2 结果与分析

2.1 42种植物甲醇提取物对番茄灰霉病菌的生物活性

试验结果表明，心籽绞股蓝、海南五针松及水马桑对番茄灰霉病菌表现出较强的抑制活性，其抑制率分别为83.68%，76.21%及60.88%，且与其余处理差异显著；在试验中也发现有些植物提取物对菌丝不但没有抑制作用，反而还具有促进作用，比较显著的是金线草，其抑制率为-22.55%；其次为冬桃（枝叶），为-14.40%，川牛膝也达到了-11.66%（表1）。

2.2 抑菌活性较好的提取物对番茄灰霉病毒力测定

表1 42种植物甲醇提取物对番茄灰霉病的抑菌活性

毒力测定结果表明，心籽绞股蓝、海南五针松及水马桑对番茄灰霉病的分别为1.000 mg/mL，3.275 mg/mL和5.050 mg/mL（表2）。

3 结论与讨论

3.1 结论

通过测定42种植物甲醇提取物对番茄灰霉病的生物活性，筛选出心籽绞股蓝、海南五针松、水马桑对番茄灰霉病具有较好的抑制作用，其抑制率均达到60%以上；通过对这3种植物提取物进行毒力测定，其有效中浓度分别为：心籽绞股蓝1.000 mg/mL、海南五针松3.275 mg/mL、水马桑5.050 mg/mL。综合以上结果表明，心籽绞股蓝对番茄灰霉病的抑菌效果最好。

3.2 讨论

本试验中发现某些植物甲醇提取物对番茄灰霉病菌有促进作用，如在5 mg/mL浓度下，金线草、冬桃（枝叶）及川牛膝的提取物对番茄灰霉病菌的抑制率分别为-22.55%，-14.40%及-11.66%。针对这种情况，其原因可能是在植物中同时存在抑菌、促菌2类活性物质。随着浓度的降低，其抑菌、促菌活性物质比例不同，导致结果不同[12]。但具体原因目前还未见报道，值得进一步研究。

心籽绞股蓝是葫芦科绞股蓝属多年生攀缘草本植物。有相关研究表明同属植物绞股蓝具一定的广谱抗菌活性[13]，其主要成分为皂苷、多糖、黄酮类化合物、有机酸和微量元素等多种化学成分[14]。广泛研究表明，皂苷与黄酮类化合物具有较强的抑菌活性，如空心莲子草皂苷类物质对细菌和真菌均有一定程度的抑制作用，对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、黑曲霉和根霉有明显的抑菌作用[15]；水溶性海参皂苷对黄瓜枯草病原菌和葡萄炭疽病菌，以及黑曲霉菌也具有显著的抑菌活性[16]；节节草地上部含有丰富的黄酮类化合物，其对大肠杆菌和八叠球菌等有明显的抑制作用[17]；苦参中黄酮类化合物也对细菌和真菌有抑制作用[18]。所以，心籽绞股蓝对番茄灰霉菌表现出抑菌效果，可能与该种植物中含有丰富的黄酮和皂苷类次生代谢物质有关，但活性物质的分离和结构的鉴定还需要进一步深入研究。

表2 3种植物甲醇提取物对番茄灰霉病菌的毒力测定

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Preliminary Studies on the Antifungal of 42 Medical Plant Species Methanol Extracts against

The antifungal activities of 42 species medical plant methanol extracts were tested on thePers. with a growth rate method.The results showed that the antifungal activities against thePers.ofCogn.ex Oliv.,Hand.-Mazz.andWall.(5 mg/mL)were better than other treatments,and the inhibition rates were 83.68%,76.21%,60.88%,respectively.Also deeply detected the toxicities of three plants againstPers.and theof them were 1.000 mg/mL,3.275 mg/mL and 5.050 mg/mL.So G. cardiospermum Cogn.ex Oliv.has shown good antifungal activity against thePers.and the active ingredients would be worthy of further study.

Pers.;Plant methanol extracts;Cogn.ex Oliv.;Antifungal activity

WANG Xuegui1,2,WU Zhihua2,SHEN Litao1,TIAN Yongqing1

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.18.028

王学贵（1976-），男，博士研究生，讲师，主要从事植物源农药研究。E-mail:wanderwxg@sican.edu.cn

2009-03-10