硝酸甘油对缺血性脑卒中神经元的保护及对ＪＮＫ信号通路的影响

张　芳　刘红芝

[摘要]目的：探讨硝酸甘油(NG)对大鼠缺血性脑卒中JNK和Bad(serl28)磷酸化的影响。方法：36只健康SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组(对照组)和硝酸甘油组。以大鼠四动脉结扎脑缺血模型为基础，应用焦油紫染色法检测海马CAl区神经元凋亡，采用免疫印迹检测JNK和Bad(ser128)的磷酸化。结果：硝酸甘油组脑海马CAl区神经元凋亡显著少于对照组(P<0.05)；硝酸甘油组JNK、Bad(ser128)的磷酸化显著低于对照组(P<0.05)。结论：硝酸甘油能显著减轻脑缺血再灌注后脑海马CAl区神经元凋亡，明显抑制JNK、Bad(ser128)的磷酸化水平，对脑缺血再灌注损伤起保护作用。

[关键词]脑缺血；硝酸甘油；海马；JNK

[中图分类号]R743[文献标识码]A[文章编号]1673－7210(2009)02(c)－020－02

硝酸甘油(nitroglycerine，NG)是一氧化氮(nitric oxide，NO)供体，而NO是非经典神经递质和细胞功能调节因子，它维持神经系统的正常功能和对缺血性脑损伤的保护作用日益受到关注，但具体机制不十分清楚。本实验通过观察NG对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡及JNK和Bad(ser128)磷酸化的影响，以探讨其脑保护作用机制Ⅲ。

1材料与方法

1.1实验动物分组

健康雄性SD(Sprague－Dawley)大鼠36只，体重250－300g，清洁级。大鼠随机分为两组，缺血15min再灌5d为甲组，再灌30min为乙组。各组又分为假手术组、缺血再灌注组(对照组)、硝酸甘油组，每组各6只。甲组用于海马CAl区神经元凋亡检测，乙组用于JNK和Bad(ser128)磷酸化测定。

1.2动物模型制备及给药方式

用20％水合氯醛(300－350 mg/kg)腹腔注射麻醉动物后，参照宋远见等的实验分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉。手术第2天于动物清醒状态下结扎双侧颈总动脉，使全脑缺血15 min，然后再灌注不同的时间，缺血时保持其直肠温度在36.5－37.5℃，以缺血动物体征表现判断缺血模型的可靠性。假手术组的处理同实验组，但不结扎双侧颈总动脉。硝酸甘油组于缺血前20 min给药，腹腔注射硝酸甘油5mg/kg。

1.3焦油紫染色

甲组于再灌注第5天以水合氯醛麻醉大鼠，然后以生理盐水和4％多聚甲醛进行心室灌注。取脑组织在4℃多聚甲醛中固定1d以上后，于梯度乙醇溶液中脱水并在二甲苯中透明。包蜡后的脑块进行切片(5μm)，经脱蜡、二甲苯，最后放于焦油紫溶液中染色。取海马CA1区1 mm内的细胞数量作为计数标准。

1.4 INK和Bad(ser128)磷酸化免疫印迹检测

乙组于再灌30min将大鼠快速断头取脑，分离双侧海马，置于液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行。从液氮中取出海马，加1.7ml匀浆缓冲液，用Teflon匀浆器高速匀浆(10 s×6次)，800g×10min离心，弃上清液，加入0.6mlbuffer B振荡摇匀，12000g×10min离心，取上清，按改良Lowry法，以牛血清白蛋白为标准蛋白测定蛋白，经过计算，各组样品配成相同蛋白浓度后分装，置80℃冰箱待用。免疫印迹法检测Bad(ser128)磷酸化：等量蛋白样品经7.5％SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)分离后，以湿转法电转移至NC膜上，转移缓冲液：25 mmol Tris，190 mmol甘氨酸，20％甲醇和0.05％SDS。转移后的NC膜经封闭液室温封闭3h后加入一抗p－JNK、p－bad(ser128)，4℃过夜。用洗涤液洗膜3遍，加入二抗羊抗兔IgG－AP，37℃反应2h，洗膜。以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。

1.5统计学方法

数据以均数±标准差(X±s)表示，以SPSS 11.0统计软件进行分析处理。所有数据经检验方差具有齐性，两组间比较采用独立样本￡检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

因本实验室以前的研究已证实，与假手术组相比，脑缺血再灌注组第5天海马神经元损伤严重：再灌注30min脑组织中JNK和Bad(ser128)的磷酸化程度显著增高(P<0.05)。故本文仅取甲组的存活神经元数、存活量表示大鼠海马CAl区神经元细胞存活情况，用乙组的JNK和Bad(ser128)数值表示大鼠JNK和Bad(ser128)的磷酸化情况。见表1。

2.1神经元存活

假手术组海马CA1区有大量细胞存活，无细胞凋亡，对照组存活细胞与假手术组相比明显减少(P<0.05)，硝酸甘油组存活细胞较对照组显著增多(P<0.05)。见表1。

2.2JNK和Bad(setl28)的磷酸化

所得免疫印迹图用图像处理仪(Gene Company)对结果分析处理，假手术组的灰度设为1，其他各组以假手术组为标准分别计算出相对值，假手术组JNK和Bad(serl28)的磷酸化有一定的水平，对照组较假手术组显著升高(P<0.05)，硝酸甘油组JNK和Bad(ser128)的磷酸化较对照组显著降低(P<0.05)，见图1。

3讨论

硝酸甘油在脑缺血再灌注损伤中的保护作用已经引起广泛关注。硝酸甘油是NO的供体，NO作为细胞间信使物质在中枢神经系统行使多种生理功能，同时它还是一种重要的脑缺血损伤介质，参与血管调节、神经递质传递、炎症、免疫反应等过程。脑海马CA1区是对缺血最为敏感而发生大量细胞凋亡的区域之一，本实验通过焦油紫染色法检测海马CA1区神经元的凋亡情况证实了这一点。在本实验中以硝酸甘油作为NO的供体，实验结果显示，硝酸甘油组海马CA1区神经元凋亡明显少于对照组，说明NO对脑缺血再灌注引起的海马CAl区神经元凋亡具有较好的保护作用。

JNK信号通路是：MLK→MKKd/7→JNKs。JNK有JNKl、JNK2和JNK三种异构体，分别由jnkl、jnk2和JNK三种基因编码。Bad(ser128)是JNK的下游信号物质，它可以和Bel－xl及Bel－2二聚化结合使与之结合的Bax置换出来，形成Bax的同源二聚体，从而逆转Bel－xl和Bel－2对凋亡的抑制作用，进一步促进细胞凋亡。本实验室研究报道，在脑缺血再灌30 min时JNK和Bad(ser128)的磷酸化达到高峰，这个高峰可促使神经元的凋亡。本实验分别检测了脑缺血再灌30 min时JNK和Bad(set 128)的磷酸化，结果显示，它们的磷酸化程度在给硝酸甘油后明显降低，提示NG能够抑制JNK和Bad(ser128)的磷酸化。本实验结果证实，NO的供体硝酸甘油可以明显下调JNK和Bad(set128)的磷酸化水平，减少神经元凋亡，对脑缺血再灌注损伤起保护作用。