微型薯多酚氧化酶的特性研究

谢奎忠 陆立银

（甘肃农业科学院马铃薯研究所，甘肃兰州，730070）

微型薯多酚氧化酶的特性研究

谢奎忠 陆立银

（甘肃农业科学院马铃薯研究所，甘肃兰州，730070）

对分离纯化后的微型薯的多酚氧化酶性质进行研究，以邻苯二酚为作用底物，用分光光度计在波长 420 nm处测定不同 pH值、反应温度、底物条件下微型薯的多酚氧化酶（PPO）活性，以讨论微型薯的褐变机理。结果表明，微型薯的 PPO最适 pH值 约为 5.5，最适反应温度为 35℃左右，该酶热稳定性差；最适作用底物为绿原酸、原儿茶酸和咖啡酸；FeSO4和抗坏血酸等化合物可以抑制 PPO活性，CaCl2和CuSO4等则起促进作用。适度高温、强酸性或碱性条件、FeSO4或抗坏血酸等处理都可以抑制该酶活性。

微型薯 多酚氧化酶 酶学性质

随着我国马铃薯产业的迅速发展，脱毒微型薯在种薯中的应用越来越广泛；因此，微型薯的贮藏问题越来越突出，储藏条件与微型薯的腐烂率、出苗率以及长势密切相关。多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一种含铜酶，它能够催化酚类物质变成醌[1～2]。近几十年来，国内外对植物组织的褐变研究表明，组织的褐变主要是由于PPO活性引起的。有关马铃薯PPO的研究早有报道，如PPO活性在不同组织中的表现，有机酸对组织中PPO活性的影响[3～4]，贮藏温度、pH值对马铃薯PPO活性的影响[5]。但是，目前对微型薯中的 PPO特性研究还未见报道。本试验对微型薯经分离纯化后的酶学特性等进行研究，以明确该酶性质，为控制微型薯在贮藏过程中褐变提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

将分离纯化后的甘农薯1号微型薯薯肉 66 kD的PPO作为酶反应液，研究其酶学性质。分离纯化参考林敏等[6]的方法进行。

1.2 试验方法

①PPO活性 PPO活性测定参考Zauberman等[7]方法进行。把0.5 mL 0.1 mol/L邻苯二酚加入1.95 mL 50 mmol/L pH值6.8的磷酸缓冲液中，在38℃下保温10 min后，加入0.1 mL酶粗提液，于波长420 nm下测定OD值变化，每隔 1 min记录1次，共记录10 min。以每分钟 OD420变化 0.01为一个PPO酶活性单位。

②PPO最适 pH值 酶反应液组成和酶活性测定条件同上，配制不同pH值 的 0.1 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液按照 Fujita等[8]的方法进行。

③PPO的最适反应温度和对温度的稳定性PPO最适反应温度测定采用 Zhou等[9]的方法进行。将1 mL 100 mmol/L的邻苯二酚、1.95 mL 0.1 mol/L pH值 6.8的磷酸缓冲液和 0.1 mL酶液混合液在不同温度（20～50℃，间隔温度为5℃）水浴中分别保温10 min，加入20%三氯乙酸2 mL终止反应，冷却至室温（18.5℃），在分光光度计 420 nm处测定光密度。PPO热稳定性测定是先将0.1 mL酶液与3.9 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液混合，分别在不同温度水浴中保温10，20，30 min，然后在冰浴中迅速冷却5 min。当混合液温度达到室温（18.5℃）时，加入1 mL 100 mmol/L邻苯二酚。之后按①的方法测定残余酶的吸收值的变化。

④底物浓度对 PPO活性的影响 用 pH值6.8的0.2 mol/L磷酸氢二钠-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液配制邻苯二酚溶液。向装有5 mL邻苯二酚溶液（1～50 μmol/L）的比色杯中加入1 mL酶液，在分光光度计420 nm处测定PPO吸收值变化，并计算酶活力。

⑤酶底物专一性 按照 Wong等[10]的方法测定。PPO反应系统含0.05 mL酶液和2.95 mL不同底物溶液（没食子酸、绿原酸、原儿茶酸、香豆酸、咖啡酸和阿魏酸等，使用 0.1 mol/L磷酸缓冲液调配，其中阿魏酸先用微量异丙醇溶解）。经 38℃保温10 min后，加入 20%三氯乙酸 1 mL终止反应，反应产物用分光光度计对 200～500 nm波长进行扫描，确定特征吸收波长，在特征吸收波长处测定光吸收值的变化。

⑥不同化合物对PPO活性的影响 将0.5 mL 0.1 mol/L的邻苯二酚与 1.85 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液和0.1 mL不同化合物溶液（CaCl2，CuSO4，EDTA，FeSO4，NaCl和抗坏血酸等，浓度均为1 mmol/L）均匀混合后，立即加入 0.05 mL酶液，用分光光度计在420 nm处测定 PPO吸收值变化，计算酶活力。酶活性大小以无化合物时酶活性百分比表示。

图1 pH值 对微型薯多酚氧化酶活性的影响

图2 温度对微型薯多酚氧化酶活性的影响

图3 微型薯多酚氧化酶对热的稳定性

图 4 底物浓度对多酚氧化酶活性的影响

表1 微型薯多酚氧化酶底物的专一性

表2 不同化合物对微型薯多酚氧化酶活性的影响

2 结果与分析

2.1 PPO最适反应pH值

以邻苯二酚为底物，微型薯66 kD的PPO最适pH值为5.5（图1）。当pH值低于3.0时，PPO不表现出活性。当pH值 大于5.5时，PPO活性迅速下降。

2.2 PPO最适反应温度和热稳定性

从温度对 PPO活性的影响（图 2）可以看出，微型薯PPO的最适反应温度为35℃。在此温度下，酶的相对活性为94%。当温度超过40℃时，PPO活性急剧降低，微型薯PPO不耐高温。

由图3可以看出，微型薯 PPO的热稳定性较差。在30℃热处理30 min，酶活性仅损失36%；但当温度高于40℃时，PPO活性损失较大。45℃处理10 min，PPO的活性损失达50%。在50℃下，保温30 min，PPO的活性损失达80%，该酶基本上失去活性。

2.3 底物浓度对PPO活性的影响

从图4底物浓度对PPO活性的影响可以看出，当底物邻苯二酚浓度低于40 mmol/L时，底物浓度与PPO活性成正比，但当浓度高于40 mmol/L时，反应速度开始下降；这可能是由于产物的积累抑制了PPO的活力。

2.4 PPO对底物的专一性

分别对微型薯肉PPO与不同种类的游离酚酸底物作用后的产物进行 200～500 nm扫描，确定特征吸收波长。从表 1可以看出，以作用于没食子酸的活力为100%计算，绿原酸的相对活力最大为324.3，是没食子酸活力的3倍；其次为原儿茶酸226.0，是没食子酸活力的2.6倍；咖啡酸的活力为132.0，是没食子酸活性的1.3倍；香豆酸、阿魏酸的相对活力小于100%。所以微型薯66 kD的PPO的最适作用底物为绿原酸、原儿茶酸和咖啡酸。

2.5 不同化合物对PPO活性的影响

不同化合物对微型薯PPO活性的影响如表 2所示。在这些化合物中，以 FeSO4的抑制效果最好，其次是抗坏血酸。CaCl2和CuSO4能够不同程度地促进PPO的活性。

3 小结

微型薯PPO的最适pH值约为5.5；最适反应温度为 35℃左右，热处理的稳定性差；最适反应底物为绿原酸、原儿茶酸和咖啡酸；FeSO4、抗坏血酸和 EDTA可以抑制 PPO活性，而CaCl2、和CuSO4则起促进作用。该酶耐热能力差，适度高温、强酸性和碱性条件、FeSO4和抗坏血酸处理均可以抑制该酶活性。

[1] Mayer A M,Harel E.Polyphenol oxidases in plants recent progress[J].Phytochem,1979(18):193-215.

[2] 宗亦臣.枣果实中酚类物质及其多酚氧化酶性质的研究[J].中国农学通报，2004，20（4）：97-99.

[3] 冉毅东，戴朝曦.马铃薯花药培养硝酸银对诱导胚状体效果的研究[J].西北农学报，1993，2（4）：43-47.

[4] 刘曼西，于秀芝.有机酸对马铃薯多酚氧化酶活性的影响[J].植物生理学通讯，1991，27（5）：350-353.

[5] 王清，王蒂.温度、pH对马铃薯多酚氧化酶活性的影响[J].中国马铃薯，2003，17（3）：157-161.

[6] 林敏，邱凌，周盛梅，等.4-卤代苯甲酸对马铃薯多酚氧化酶的抑制效应[J].食品科学，2008，29（5）：56-59.

[7] Zauberman G,Ronen R,Akerman M,et al.Postharvest retention of the red colour of litchi fruit pericarp[J].Scientia Horticulture,1991,47:89-97.

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[9] Zhou P G,Smith N L,Lee C Y.Purification and some propertiesofMonroeapplepeelpolyphenoloxidase[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry,1993，41：532-536.

[10]Wong T C,Lun B S,Whitaker J R.Isolation and characterization of polyphenol oxidase isoenzymes of clingstonepeach [J].Plant Physiology,1971，48：19-23.

Study of Polyphenol Oxidase in Min-tuber Potato

XIE Kuizhong，LU Liyin
(Potato Research Institute,Gansu Academy of Agricultural Sicence,Lanzhou 730070)

Properties of polyphenol oxidase extracted and purified from min-tubers potato were studied to investigate the theory of browning.Polyphenol oxidase activities were spectrophotometrically determined at 420 nm with catechol as substrate at different pH,temperatures and substrate concentrations and so on.The optimum pH for PPO activity was 5.5 with catechol as substrate.The enzyme was relatively stable at low temperature,with the maximum activity was observed at 35℃.Chlorogenic acid,Protocatechuic acid,and Caffeic acid were good substrates for the enzyme.FeSO4and ascorbic acid markedly inhibited PPO activity,whereas CaCl2and CuSO4enhanced the activity.PPO of min-tuber potato was stable at low temperature,high temperature,high pH and ascorbic acid can inhibited the activities of the enzyme.

Min-tubers potato;Polyphenol oxidase;Enzymatic properties

10.3865/j.issn.1001-3547(x).2009.01.012

甘肃省科技厅重大专项“贮藏保鲜技术与设施产业化示范”的子课题“马铃薯贮藏条件设施技术改造”项目(0702NKDA035)；甘肃农业科学院自列项目资助。

谢奎忠（1979-），男,硕士，主要从事马铃薯生理生态与栽培技术的研究工作，电话：0931-7614641。E-mail：xiekz@yahoo.com.cn

2008-11-21