皮肤致敏性动物替代模型的研究进展

曹玉萍　马鹏程　刘维达

曹玉萍综述，马鹏程 刘维达 审校

随着人们对生存环境及动物保护的热切关注，自动物实验的减少（reduce）、优化（refine）和替代（replace）这一3R原则提出以来，生命科学研究尽量避免使用传统的试验对象---动物，以器官培养、细胞培养、人工器官的构建等等取而代之。在皮肤科领域，各种接触皮肤的外用药物及各类化妆品除了对皮肤起到治疗和美化作用以外，人们十分关注它们是否会给皮肤造成伤害；另外，过敏性皮肤病是十分常见，传统的检测皮肤致敏性的方法主要是以豚鼠为研究对象的最大值实验、封闭型斑贴实验和开放型斑贴实验，以及人体斑贴实验。本文就近年来引起了广泛关注的皮肤致敏性动物替代模型进行了综述。

1减少和优化动物实验的方法

经典的豚鼠相关的检测致敏性的实验方法多是选取20～30只豚鼠，通过涂抹或皮下注射受试物和福氏完全佐剂数十天后，给予激发剂量的受试物，观察豚鼠局部皮肤红斑，结痂，水肿形成等对受试物的致敏性作出评价。

作为替代的小鼠实验方法有鼠耳廓肿胀试验法（mouse ear swelling test，MEST）、非侵入性鼠耳廓肿胀分析法（noninvasive mouse ear swelling assay，MESA）和小鼠局部淋巴结分析法（local lymph node assay，LLNA）。MEST和LLNA均已通过实验室间的验证，推荐为可靠的检测中等到高度致敏物质的方法。1992年经济合作与发展组织（OECD）关于皮肤致敏的相关条例指出MEST和LLNA作为第一阶段的检测手段，一旦两种中的任何一个出现阳性结果，该物质可被认为是潜在的致敏物质，而无须进行豚鼠实验，若为阴性检测结果，则需进一步进行豚鼠实验以进一步验证[1]。

1.1 鼠耳廓肿胀试验法：MEST法出现于20世纪80年代，该方法是预先向小鼠腹部皮内注射福氏完全佐剂，再多次用胶带剥脱法剥离角质层后，涂受试物，10天后，将受试物涂于一侧耳廓，分别记录涂药前后24h及48h耳廓厚度的变化，鼠耳廓肿胀厚度超过20%者判为致敏物[2]。作为一种耗资低、试验周期短、评分客观，可定量的方法替代豚鼠实验用于检测化学物质引起的迟发性接触超敏反应，而且该方法的判断指标不易被受试物颜色干扰，随后推广至光毒反应、光敏反应等。

1.2 非侵入性鼠耳廓肿胀分析法：MESA法作为接触性过敏性皮炎的检测手段，是迟发型超敏反应的模型，基本方法为在小鼠腹部局部涂抹受试物使之致敏，5天后，在耳部皮肤外用同一受试物，在24h，48h，72h后测量耳部的肿胀程度，评估受试物致敏潜能。与MEST法相比，它的优点在于少了很多侵入性的操作，如向小鼠腹部皮下注射福氏完全佐剂、麻醉小鼠、破坏腹部皮肤的角质层屏障等，此外，它还可检测极低浓度的已知致敏物导致接触性致敏性皮炎的潜能，给予小鼠高维生素A饮食时， MESA法的反应强度可放大数倍，可用于弱效致敏物的检测。给予高维生素A饮食时的MESA法可检出一般饮食MESA法和豚鼠实验中出现假阴性物质，MESA法灵敏度高于人体试验，与豚鼠实验相当[3]。

1.3 小鼠局部淋巴结分析法：LLNA法原理是皮肤接触致敏物，在致敏阶段可引起局部引流的淋巴结内T细胞发生活化和增殖。设置高中低三个浓度实验组和赋形剂对照组，每组4～5只小鼠，连续3天在耳背外用受试物，用放射性元素3H标记的胸腺嘧啶核苷由尾静脉注入小鼠体内，5h后处死，取其耳旁淋巴结制成单细胞悬液，测定细胞分裂数，增殖超过3倍以上判为致敏物。该方法进一步减少了动物使用数量，减轻了实验动物的痛苦，经改良后，用无放射性的5-溴-2-脱氧尿苷或荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）代替放射性元素来减少放射性污染。与豚鼠实验、MEST法和人体最大值试验相比，该方法稳定且特异，检测指标客观，且可定量[4-5]。该法早在1990年就获得了ECVAM认证作为皮肤过敏试验的替代方法。虽会出现一定的假阳性率，如对刺激物十二烷基磺酸钠（SDS）反应阳性，但在替代传统的动物试验上具有重大意义和优势[4]。

2完全替代动物实验的方法

在MEST法、MESA法和LLNA法中，尽管以小动物替代了大动物，减少了动物的用量，但对实验动物仍有需求，而动物替代方法的最终目标是要找到合理的方法完全替代实验动物，因此，科学家们一直在寻找各种能替代动物实验的细胞培养方法。

2.1 单种细胞的培养

皮肤变态反应的机制涉及角质形成细胞和Langerhans细胞，在受到外源性物质刺激后，角质形成细胞分泌各种细胞因子，包括IL-1α、TNFα、GM-SCF、IL-8、IFNγ等等。Langerhans细胞接受微环境的刺激，表达各种成熟标记物如CD86、CD54、CD40、CXCR4等等，分泌细胞因子如IL-1β等。

2.1.1 角质形成细胞的液面下培养：以细胞为基础的皮肤变态反应替代模型最初以角质形成细胞为研究对象，在众多分泌的细胞因子中，IL-8、IL-1α的变化更有代表性。商品化的人角质形成细胞、鼠源性角质形成细胞株HEL30及原代培养的角质形成细胞，发现IL-8在多种刺激物作用后增加，而致敏物作用后其基线水平不改变或降低。IL-1α在接触致敏物接触后可导致其在细胞内分泌量增加，而刺激物及致敏物均导致其自细胞内的释放量增加，不仅如此，细胞因子分泌模式因化学物质的不同也有较大的差异[6]。

2.1.2 角质形成细胞的三维培养：与单纯的细胞液下培养相比，三维培养更接近正常生理结构，体外实验数据更准确可靠。角质形成细胞三维培养建立起角质层屏障，将外源性物质的渗透能力纳入考察范围，更符合皮肤变态反应机制。Coquette A等[7]以气液界面培养的方法建立人角质形成细胞的三维培养体系，在该体系中，角质形成细胞分化出角质层、颗粒层和棘层。形成较为完备的角质层屏障，以细胞因子IL-1α和IL-8的变化作为评价指标，刺激物作用时，IL-1α水平显著升高，而在中等或强效致敏物作用下，IL-8分泌量的增加更为显著。在单层细胞培养体系和三维培养体系中，IL-8分泌的不同可能是由于化学物质在单层培养体系中直接作用于细胞，而三维培养体系中需要透过角质层屏障才能对角质形成细胞起作用导致的。

目前以鼠尾胶原和成纤维细胞构成的组织工程真皮为支撑的角质形成细胞的三维培养模型已经作为人工皮肤得到广泛运用，如Episkin、EpiDerm等产品已获得欧盟替代方法验证中心通过，作为检测化学物质的皮肤刺激性的动物替代方法运用于化妆品的生产中。

但尚无类似产品可用于致敏性的检测，原因可能在于角质形成细胞三维培养模型中不含专职的免疫细胞，而皮肤变态反应是一个典型的有专职免疫细胞参加的过程，在变态反应中，角质形成细胞与Langerhans细胞通过细胞因子产生相互影响。该模型所检测物质限于中等或强效者，是否具有足够的灵敏度检测出致敏作用很弱的化学物质还不清楚。

2.1.3 树突状细胞的液面下培养：角质形成细胞的培养模型是通过检测细胞受到刺激物或致敏物作用后，IL-1α和IL-8的改变，从而做出判断。但细胞因子的分泌模式在一定程度上有化学物质的特异性，导致假阳性和假阴性的出现。因为不是专职的免疫细胞，角质形成细胞模型不能较好的区分刺激物和致敏物。

Langerhans细胞作为皮肤中主要的抗原递呈细胞，占表皮细胞数目的3%，但在皮肤变态反应中起着关键作用，它不易从皮肤中分离，即使分离得到，不仅产量低，且细胞活力差[6]。有人将脐血或骨髓中CD34+造血祖细胞诱导培养成树突状细胞，或将外周血来源的单核细胞诱导成树突状细胞，检测细胞表面标记物HLA-DR、CD54、CD80、CD86的变化区别致敏原及刺激物，结果发现此类体外模型敏感性不够高，且细胞制备周期复杂，耗时长，同时存在细胞供体不同的个体差异性[8]。为解决个体差异性问题，多种单核细胞永生化细胞系受到极大关注，如THP-1细胞、MUTZ-3细胞、KG-1细胞、U937细胞等，虽然U937细胞构建的模型表现出敏感性不高，具有中度致敏潜能的羟基肉桂酸被误检为阴性[9]。KG-1细胞、U937细胞针对致敏化学物质的反应因所检测物质的理化性质不同而出现各种反应，特异性不够高，而且无法将致敏物和刺激物区分开。但THP-1细胞、MUTZ-3细胞代表性较好，对化学物质致敏潜能的反应主要表现为细胞表面标记物（CD86、CD54）表达水平上调，而刺激物则不影响CD86、CD54的表达[10]。Sakaguchi等[11]建立h-CLAT模型分析了THP-1细胞活力及CD86/CD54表达与体外皮肤致敏性检测之间的关系，以CD86≥150，CD54≥200为标准，判断致敏物的准确度在93%，这一标准与LLNA的EC3标准有很好的一致性。除了检测免疫细胞表面共刺激分子的变化，以鼠源性的树突状细胞为研究对象，发现致敏物不仅使细胞表面CD40表达增加，同时CXCR4的水平也明显提高，而刺激物则降低两者的表达水平[12]。

除了以各类细胞标志物为终末检测指标以外，Hooyberghs等[13]以来源于73名志愿者的CD34+造血祖细胞诱导培养成的树突状细胞为对象，在三个不同的时间点，用三种不同浓度的致敏物或刺激物作用于培养的细胞，通过13个基因的转录组分析来区别致敏物和非致敏物，一致性达89%，特异性高达97%，敏感性为82%。

上述诱导的树突状细胞及替代Langerhans细胞的细胞系都存在两方面的问题：①这类单细胞培养模型缺乏角质层屏障，无法考察受试化学物质经角质层屏障的渗透能力；②一种细胞的单层培养模型缺乏角质形成细胞与Langerhans细胞间的相互影响，不能完全反映人体变态反应过程。

2.2 多种细胞的培养

为了解决单种细胞培养模型中的检测指标特异性不够强，敏感性不够高等问题，参照变态反应发生的不同环节，建立多种细胞共培养和三维培养是动物替代试验发展的新趋势。

2.2.1 角质形成细胞与Langerhans前体细胞的共培养：通常认为在致敏物接触局部皮肤时，角质形成细胞受到致敏物的刺激后，分泌IL-1α、IL-8等细胞因子，向Langerhans细胞提供危险信号，提高Langerhans细胞对致敏物的敏感性。脐血或骨髓CD34+造血前体细胞，或外周血的单核细胞，在某些细胞因子作用下能发生诱导分化，具有Langerhans细胞相关的免疫功能，Schreiner等[14]将角质形成细胞与来源于外周血的CD14+单核细胞共培养，加入GM-SCF、IL-4、TGFβ等诱导CD14+单核细胞分化成树突状细胞，用于检测化学物质的致敏性，发现致敏物三硝基苯磺酸、对苯二胺、4-氨基乙酰苯胺等接触性致敏原可使培养体系中的树突状细胞表面CD86表达增加，刺激物十二烷基磺酸钠则不会引起类似的变化。

2.2.2 Langerhans前体细胞与T细胞的共培养：皮肤变态反应致敏期，Langerhans细胞接触致敏化学物质，发生活化，分泌IL-1β，摄取加工抗原，逐渐成熟，向局部淋巴结迁移，激活初始辅助性T细胞，使之发生活化增殖。基于这一机制，Rouginer等[15]用来源于脐血CD34+造血干细胞的Langerhans细胞样树突状细胞，或将外周血中的单核细胞经GM-SCF、IL-4等细胞因子诱导，得到有成熟树突状细胞表型的细胞，作为抗原递呈细胞受到强效致敏物作用后，能诱发自体初始T细胞大量增殖，但弱致敏原或刺激物SDS则不会引起类似变化。

2.2.3 含有多种细胞的三维培养：人表皮含有角质形成细胞、Langerhans细胞、黑素细胞和迈克尔细胞。仅角质形成细胞的三维培养或各类两种细胞的液下共培养体系不能完全反映出人体皮肤屏障作用，且树突状细胞、T细胞的来源，不同供者间的差异都成为该类模型进一步发展的难题。将CD34+造血祖细胞、角质形成细胞和黑素细胞三者共培养于真皮支架上构建出组织工程皮肤，更接近正常人皮肤[16]。Facy V等[17]建立了分层培养的角质形成细胞与CD34+造血祖细胞共培养模型，2，4-二硝基氟苯、对苯二胺等致敏物可导致IL-1β、CD86过度表达。该模型采用来源于脐血的CD34+造血祖细胞，来源少，存在个体差异，无法推广。最近，Uchino等[18]成功的建立了含有角质形成细胞和树突状细胞的三维培养模型，将致敏物/非致敏物暴露于这种新的皮肤模型上1h，测得致敏物可导致该模型中细胞因子分泌增加，且树突状细胞表面CD86表达增加，而非致敏物则不会引起上述改变。

3结语

各种替代动物实验的方法已广泛开展，检测致敏性的动物替代模型在化妆品检测中尤为重要， 2009年起禁用动物进行化妆品的各项安全性测试已列入WTO协议的相关条款，随着皮肤变态反应机制研究的深入，皮肤致敏性检测模型从最初的动物模型逐渐发展为细胞液下培养模型，考虑到细胞间相互影响以及角质层屏障，多种细胞的共培养模型及三维培养模型成为热点，但细胞来源及个体差异性仍未得到很好的解决，检测指标由最初的细胞因子和细胞表面标记物的变化，逐渐发展到通过相关基因的检测来判断化学物质是否致敏。Koeper等[19]用鼠皮肤移植物，人皮肤移植物以及人工皮肤模型研究致敏物对信号传导通路的影响，发现在皮肤移植物中，三种MAPK均被致敏物活化，而对刺激物无反应。在人工皮肤模型中，致敏物作用后可检测到磷酸化p38和JNK1/2，刺激物作用后可检测到ERK1/2。MAPK细胞信号通路为皮肤致敏性检测提供了一个新工具。随着皮肤变态反应深入研究，皮肤致敏性检测模型的发展从解决细胞来源，存在批间差异等问题着手，在保证灵敏性和特异性的前提下，寻找来源广，性状稳定均一，与角质形成细胞构建三维模型复制性强的能体现Langerhans细胞相关功能的免疫细胞是未来动物替代方法发展的方向。另一方面，对于终末检测指标的确定，从细胞因子、表面标记物发展到基因表达的检测和细胞信号转导通路的研究，越来越深入细致。能提高检测的灵敏度的多种检测指标的组合将是未来研究的方向。

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[收稿日期]2008-11-15[修回日期]2009-01-05

编辑/张惠娟