持续静压力对人牙周膜成纤维细胞ＲＡＮＫＬｍＲＮＡ分泌活性的影响

吴承琼　周　洪　王晓荣

[摘要]目的：研究持续静压力(continuously compressive pressure,CCP)对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament cells,HPDLs)核因子受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)分泌活性的影响，初步探讨其在正畸性骨改建中的作用机制。方法：用组织块酶消化法培养获得人牙周膜成纤维细胞。建立空气静压力加载模型，分别对细胞加载0、50、100、150、200持续静压力0、0.5、1、1.5、2、4、6、12h，利用逆转录聚合酶链反应法(reverse transcription-polymerase chain reation,RT-PCR)检测RANKLmRNA分泌活性的变化。 结果：牙周膜细胞在持续静压力作用下RANKLmRNA表达增强，100Kpa加压1.5h时，RANKLmRNA的表达达峰值。结论：持续静压力可上调人牙周膜成纤维细胞RANKLmRNA的表达。

[关键词]牙周膜细胞；静压力；核因子受体活化因子配体；逆转录聚合酶链反应

[中图分类号]R783.5[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2009）02-0210-04

Effect of continuously compressive pressure on espression of RANKLmRNAin human periodontal ligament fibroblast in vitro

WU Cheng-qiong,ZHOU Hong,WANG Xiao-rong

（Department of Orthodontics,the Affiliated Stomatological Hospital,Medical School of Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,Shaanxi,China)

Abstrcat:ObjectiveTo study the effect of continuously compressive pressure(CCP) on the expression of receptor activator of nuclear factor kappa B ligand(RANKL) in human periodontal ligament cells(HPDLs),and to investigate the role of continuously compressive pressure in alveolar bone rebuilding during orthordontic tooth movement. MethodsHPDLCs were isolated from human periodontal ligament by explanting enzymatic digestion with trypsin and collagenase. Estanblish a pressure model ,sustained static pressure 0Kpa、50 Kpa、100 Kpa、150 Kpa、200 Kpa were laid on HPDLCs for 0h、0.5h、1h、1.5h、2h、4h、6h、12h, respectively. The RANKL expression was identified by reverse transcription-polymerase chain reation(RT-PCR). Results The expression of RANKLmRNA significant increased after pressure exposed, especially in the group of 100 Kpa pressure lasted for 1.5 hours. ConclusionCCP can up-regulate the expression of RANKLmRNA in HPDLFs.100 Kpa pressure lasted for 1.5 hours was the suitable condition.

Key words: human periodontal ligament fibroblasts;continuously compressive pressure;RANKL;RT-PCR

正畸牙移动是一个复杂的机械生物学反应过程，牙周组织感应力学刺激后所发生的组织改建是牙齿移动的基础。牙周膜细胞是正畸矫治力的直接感应细胞[1]，能将所受到的机械应力转化为细胞内外的生物化学信号，又是正畸力的效应细胞[2]，在外力的作用下可分泌并释放多种细胞因子，同时参与了骨吸收和骨形成的过程。体外实验证明对牙周膜细胞施加机械力，细胞表达RANKL增强，RANKL作为骨吸收过程中的关键因子，在破骨细胞的分化和活化过程中其着重要的作用。近年来，RANKL已作为骨代谢途径的关键因子而被广泛关注。本实验通过对HPDLFs施加不同大小和不同作用时间的持续静压力，观察静压力条件下RANKL表达活性变化，寻找诱导牙周膜细胞在齿槽骨改建中发挥作用的最佳作用力值和作用时间。

1材料和方法

1.1试剂及仪器：主要试剂有：DMEM培养基（低糖）（GIBCO公司，美国）、胎牛血清FBS（灏洋，天津）、0.25%胰蛋白酶（Sigama公司，美国）、SABC免疫组化试剂盒、波形丝蛋白单克隆抗体，角蛋白单克隆抗体（博士德公司，杭州）、I型胶原酶（Sigama公司，美国）；主要仪器有：全自动高压灭菌锅HV-50 (HIRAYAMA,日本)；低温高速离心机(3K18) (Sigma,德国)；倒置显微镜 (Nikon, 日本)；CO2培养箱(BB16) (Heraeus,美国)；超净工作台(BCM-100A) (中国，苏州)；空气静压力细胞加载系统（自制）。PCR扩增仪（9700型）(ABI，美国）；电泳仪（EPS-301）（Amersham，瑞典）。

1.2 HPDLCs的培养与鉴定：取西安交通大学口腔医院口外门诊12～18岁健康青少年因正畸拔除的第一前磨牙，刮取牙根中1/3的牙周膜组织后剪碎，1 200r/min离心5min，弃上清，加入2g/L的I型胶原酶1～2mL，吹打混匀，置于37℃恒温箱中消化30min，每隔5min振荡摇匀一次。当肉眼观察到液体浑浊，组织块明显变小时加入含FBS150mL/L的DMEM培养液终止消化，1 200r/min离心5min，弃上清，加入DMEM培养液重悬后置于塑料培养瓶中，37℃、50mL/L CO2培养箱中培养。24h后加培养液至3mL，获得原代细胞，每3～4天换液。将细胞传至第4代备用，以波形丝蛋白抗体和角蛋白抗体染色鉴定细胞。

1.3 HPDLCs静压力加载模型的建立：实验用传代培养的第四代人牙周膜细胞，等细胞生长至对数生长期时，全量更换培养液，培养12h，把细胞培养瓶放入压力加载装置的密闭容器里，旋松培养瓶盖；调整容器内温度为37℃，检查装置后，对各实验组施加0、50、100、150、200Kpa的持续静压力作用0、0.5、1、1.5、2、4、6、12h，加力完成后立即收集细胞和条件培养液。-70℃冰箱保存。

1.4 RT-PCR检测细胞RANKLmRNA的表达

1.4.1细胞总RNA的提取：按trizol试剂盒说明提取细胞总RNA。在紫外分光光度计上分别读取260nm、280nm的OD值以检测RNA的纯度和浓度。

1.4.2 引物设计与合成：引物由北京奥科生物技术有限公司合成。（见表1）

1.4.3 cDNA的合成：按试剂盒说明，配置RT反应液，试剂配好后，轻轻混合均匀，低速离心数秒，将PCR反应管放置到PCR扩增仪上进行RT反应。反应条件：25℃ 10min，50℃ 45min（反转录反应），95℃ 5min（灭活逆转录酶），4℃ 5min。

1.4.4 PCR扩增：按照试剂盒说明配置PCR反应液，扩增条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min共35个循环，72℃彻底延伸10min，4℃保存。

1.4.5 积分光密度值的测定：用0.5%的TAE缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，将PCR的反应产物各5μl在琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在自动凝胶成像仪观察结果，照相，对电泳的结果进行图像灰度分析。

1.5 统计学处理：用SPSS13.0统计软件处理数据，分别以时间和力值因素分组，作单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义。

2结果

2.1 牙周膜细胞的培养及鉴定：在倒置相差显微镜下观察，可见大多数细胞呈长梭形，为单核细胞，有长短不一的数个细胞突起，胞体丰满，胞核椭圆形、居中，胞浆丰富，细胞贴壁生长，此为牙周膜成纤维细胞（如图1A）。波形丝蛋白染色呈阳性，胞浆棕黄色着色；角蛋白染色阴性（如图1B）。

2.2 加力后细胞形态观察：牙周膜细胞加力后，生长良好，细胞排列整齐致密，呈长梭形，少数细胞变圆。（如图2）

2.3 RNA纯度检测：经测量，RNA纯度及浓度均较高，符合PCR试验要求。

2.4 PCR产物电泳结果和积分光密度值 ：PCR产物电泳条带清晰，无明显杂带，条带位置与引物设计相符。图3A为100 Kpa加力组RANKLmRNA的表达变化，加力时间从左到右依次为0、0.5、1.0、1.5、2、4、6、12h。加力后RANKLmRNA的表达增加，加力1.5h时增至最大，随后又下降。图3B为1.5h组RANKLmRNA的表达变化，从左到右，加力大小依次为0、50、100、150、200Kpa。加力后RANKLmRNA的表达增加，加力100 Kpa时增至最大，随着力值的继续增大，RANKLmRNA的表达反而下降。

测量各电泳带的OD值，以内参β-actin mRNA为参照，计算出RNKL/β-actin OD比值。分别以时间和力值因素分组，作单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义。分别以力值和时间分组，分析OD比值的变化：各力值组加力后，OD比值均上升，加力1.5h时，OD比值升高达峰值。随后OD比值反而下降。就力值大小比较，不同加力时间组加力后，OD比值均上升，力值为100Kpa时，OD比值最大，随力值增大，OD比值反而下降。（如图4～5）

3讨论

正畸牙齿移动的生物学基础是牙周组织的改建，而牙周组织改建成功的关键则取决于牙周膜中参与组织再生的细胞-牙周膜细胞。牙周膜细胞位于牙与牙槽骨之间，是正畸力的直接效应细胞。在机械应力作用下，牙周膜细胞做出相应的应激反应，从而调控牙槽骨的形成或吸收。大多数学者[3]的研究表明牵张力作用可使得牙周膜细胞成骨作用增加。而迄今为止，很少有学者单独利用体外培养细胞的方法研究牙周膜细胞对机械压力的反应，因此，机械压力和骨吸收之间的关系以及在骨组织中如何在特定的部位形成骨吸收陷窝的机制仍不十分清楚。Kanzaki[4]首次将牙周膜细胞和外周血单核细胞共培养后施加机械压力，发现牙周膜细胞内RANKL mRNA的含量增加。黄生高，张建兴[5]等发现对人牙周膜细胞施加压力后人牙周膜细胞内RANKLmRNA 升高，且呈时间依赖性。推测，当人牙周膜细胞在体内感受到正畸压力后，经过一系列的信号转换，细胞内RANKLmRNA表达增强，RANKL蛋白合成增加，细胞表面RANKL的表达也随之增加，召集牙周膜内外周血单核细胞并与之接触，在巨噬细胞集落刺激因子的共同作用下使之增殖、分化为破骨前体细胞，并进一步分化为破骨细胞，从而启动了压力侧的骨吸收。

RANKL是近年来研究较多的骨代谢因子，在骨和骨髓微环境中，RANKL的主要来源是骨髓基质细胞、成骨细胞、牙周膜细胞、软骨细胞。直接参与骨代谢的RANKL由成骨/基质细胞分泌，通过旁分泌方式发挥作用，RANKL的主要作用机制是与成熟破骨细胞胞膜表面的核因子-кB受体活化因子（RANK)相结合，刺激破骨细胞分化，加强成熟破骨细胞的活性，抑制破骨细胞的凋亡，RANKL能直接诱导破骨细胞分化发育并参加破骨细胞功能调节，参与破骨细胞分化、融合、生存、激活的全过程[6-8]。同时成骨细胞/牙周膜细胞还分泌骨保护素（OPG），OPG可以与RANKL结合，竞争性的抑制破骨细胞的分化和活化[9]。机体调节通过RANKL和OPG的合成比例来调节破骨细胞的形成和活化以调节骨吸收平衡。

细胞动力学是现代生物力学发展的前沿领域，其研究基础和关键是细胞加载技术，体外细胞加载装置的建立，使我们能够对细胞在体外受力后发生的结构、功能及代谢的改变进行深入细致的研究。1939年，Glucksmann在体外细胞力学加载方面，进行了开拓性的研究。1975年Rodan等开创了机械应力作用培养细胞和组织相关研究的新时代。经过多年的改进和发展，已研制出多种体外细胞加力装置[10-11]。大致分为：离心力加载、流体加载、单个细胞加载、压力传导加载、基底膜形变加载和空气静压力加载等装置。本实验选择由Banes设计的真空操作装置并加以改良，解决了以往对体外细胞加力方法不足的问题。该装置可以提供静压力和间歇性可变压力两种方式，在气体静压力作用下，每个细胞受力大小均匀，压力值肯定，压力调节范围大，且操作简单，是一种较为理想的加力装置。

牙周膜细胞在牙槽骨改建中起着极其重要的作用，在对牙周膜细胞生物力学研究中要不断改进细胞体外培养技术，不断寻找最佳的加力装置和最适宜的加载条件，以便于在细胞生物力学研究中取得新的成果。本实验选取牙周膜细胞表达的最关键的骨代谢因子RANKL，通过对牙周膜细胞施加不同大小和不同加载时间的持续静压力，检测牙周膜细胞中RANKLmRNA的表达变化，以寻找诱导牙周膜细胞在齿槽骨改建中发挥作用的最佳作用力值和产生作用时间。通过对牙周膜细胞施加不同大小和作用时间的持续静压力，发现牙周膜细胞在受到100Kpa的持续静压力作用1.5h后，RANKLmRNA的表达最高，100Kpa，1.5h的加载条件有利于研究牙周膜细胞在骨吸收过程中的作用。

本实验通过对体外培养的人牙周膜成纤维细胞施加一定持续静压力，检测人牙周膜细胞中RANKLLmRNA表达变化，寻找静压力对牙周膜细胞最佳的作用力值和加力时间，为以后实验压力加载提供指导，为进一步研究压力刺激下，牙周膜细胞诱导破骨细胞生成的信号转导通路奠定了基础；对于临床工作中提高治疗效果、缩短治疗时间也有着重要的指导意义。

[参考文献]

[1]Kanzaki H,Chiba M,Shimizu Y,et al.Periodontal ligament cells under mechanical stress induce osteoclastogenesis by receptor activator of nuclear factor kappa B ligand up-regulation via prostaglandin E2 synthesis[J].J Bone Miner Res,2002,17(2):210-220.

[2]Fretz JA,Shevde NK,Singh S,et al.Receptor activator of nuclear factor kappa B ligand induced nuclearfactor of activated T Cells(C1) autoregulates its own expression in osteoclasts and mediates the up-regulation of tartrate-resistant acid phosphatase[J].Mol Endocrinol,2008,22(3):737-750.

[3]杨 瑛，张 丁，傅民魁,等.不同加力时间点人牙周膜细胞中核心结合因子(Cbfal) mRNA 的表达变化[J].口腔正畸学,2004 ,11(3):119-121.

[4]Kanzaki H,Chiba M,Shimizu Y,et al.Dual regulateon of osteoclast differentiateon by periodontal ligament cells through RANKL stimulation and OPG inhibition[J].Dent Res,2001,80(3):887-891.

[5]黄生高,张建兴,熊培颖,等.持续静压力对人牙周膜细胞RANKLmRNA 表达的影响[J].中南大学学报(医学版),2006,31(4): 518-522.

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[11]张建兴，黄生高. 人牙周膜细胞体外培养和机械压力模型构建[J].口腔医学研究，2006，22(1):38-42.

[收稿日期]2008-11-20[修回日期]2009-01-09

编辑/何志斌