血管内皮生长因子１６５基因转染的骨髓基质细胞异位成骨的初步研究

高全文　柳春明　宋慧锋　柴家科

[摘要]目的：将血管内皮生长因子165（VEGF165）基因转染的大鼠骨髓基质细胞（MSCs）和β-磷酸三钙复合后，植入原大鼠肌肉中，探索转染外源基因的MSCs异位成骨能力。方法：SD大鼠12只，在全麻及无菌条件下取其左侧股骨的骨髓基质细胞，并用矿化液诱导培养。在脂质体介导下将构建成功的真核表达载体pcDNA3.1- VEGF165转染到诱导培养的MSCs，G-418筛选阳性细胞克隆，将阳性克隆细胞和未转染的MSCs共同接种于β-磷酸三钙上，体外培养7天后，植入原大鼠肌肉内。分别于4周、8周和12周处死动物，观察异位成骨情况。结果：骨髓基质细胞－β-磷酸三钙复合体植入肌肉后，材料周围血管生长较多，随着植入时间的延长，小的骨岛逐渐融合为大的骨块，并有骨髓腔样结构，表现出较好的异位成骨能力。结论：应用VEGF165基因转染MSCs作为种子细胞植入体内后，有利于发挥VEGF165的血管化作用，同时促进组织工程骨的成骨速度，将会成为组织工程骨血管化探索的方向。

[关键词]血管内皮生长因子165；骨髓基质细胞；β-磷酸三钙

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）01-0069-03

A primary study on the osteogenic characteristic of MSCs with VEGF165 gene

GAO Quan-wen1,LIU Chun-ming,SONG Hui-feng,CHAI Jia-ke

（1.Department of Burn and Plastic Surgery，the First Hospital Affiliated to PLA General Hospital, Beijing 100037，China; 2.Department of Plastic Surgery, PLA General Hospital，Beijing 100853，China）

Abstract： ObjectiveTo investigate the osteogenic characteristic in vivo of rat bone marrow stroma cells (MSCs) with Vascular endothelial growth factor 165 gene (VEGF165) combined onto β-tricalcium phosphate（β-TCP）.MethodsMSCs were obtained from femurs of 12 SD rats under general anesthesia and sterile condition, and cultured in DMEM supplemented with 10%FBS. MSCs were cultured in a conditional medium in subculture including: dexamethasone, vitamin C, and β-glycerophosphate. At the same time, we constructed the eukaryotic expression vector containing VEGF165gene. VEGF165 gene was transfected into MSCs by means of LipofectAMINE?2000. The stably gene expressive cells were screened with G-418 for 14 days. The cell mixture were combined onto β-TCP and cultured in vitro for 7 days. The cells-ceramic compound was implanted intramuscularly into the corresponding rat. These rats were executed after 4w, 8w, 12w.The osteogenic characteristic in vivo were investigated by histochemistry.ResultsAs the time passed, much osseous island changed large osseous block. It showed that the cells-ceramic compound implanted intramuscularly could be osteogenesis.ConclusionWhen VEGF165 gene was transfected into MSCs, there were blood vessel around the osseous island. VEGF165 could improve vessels growth and accelerate osteogenic of tissue engineering bone. The experiment was an interesting research of vascular tissue engineering bone.

Key words：vascular endothelial growth factor 165; bone marrow stroma cells; β-tricalcium phosphate

骨缺损的治疗一直是临床上棘手的问题。近年来，由种子细胞和生物材料组成的组织工程骨研究进展迅速，为解决骨缺损提供了探索方向。但是，组织工程骨面临迅速血管化的重要问题，同其他类型移植骨一样，充分的血液供应是保证组织工程骨在体内存活的决定因素。Ferrara[1]等研究认为VEGF165是体内促进血管生长的主要因子。为此，本实验将VEGF165基因转染细胞到骨髓基质细胞中，并就VEGF165影响成骨的特点进行初步探索。

1材料和方法

1.1 试剂与材料：DMEM培养液购自Gibco，限制性核酸内切酶BamH I、Xho I及T4 DNA连接酶，均购自TaKaRa(大连)有限公司。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自华舜公司。鼠抗人血管内皮生长因子单抗（mAb）购自福建迈新公司。E.coli DH5α、质粒pcDNA3.1及pSP73-VEGF165，均为第四军医大学生化教研室李福洋博士惠赠。G418和脂质体LipofectAMINE2000购自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓基质细胞的培养：150g成年雄性SD大鼠12只，3％戊巴比妥钠腹腔注射全麻后，取左侧股骨和胫骨。在超净台中将骨髓细胞冲入DMEM培养液中，置入37℃、5%CO2培养箱中培养，24h后换液，以后每隔2天换液1次。第8天，用矿化诱导液培养持续1周，骨髓基质细胞向成骨细胞分化，诱导后的细胞行传代培养。

1.2.2真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165的构建 具体过程详见文献[2]。

1.2.3 脂质体介导下VEGF165转染MSCs：于转染前1 天，将原代培养的骨髓基质细胞用2.5g/L的胰酶消化、计数，并按1×109 细胞/L 接种于6孔板中。当细胞长满至90%～95%时，将pcDNA3.1- VEGF165转染大鼠骨髓基质细胞（同时设立未转染的空白对照），具体操作按LipofetAMINE2000试剂盒中的说明书进行，将转染的细胞置于37℃、5%CO2孵箱中培养24h (期间不必换液)。翌日，以G418（300 mg/L）进行筛选，3天换液1次，培养14 天后，获得阳性细胞克隆。

1.2.4 MSCs与β-磷酸三钙复合体的构建：将体积为5mm×2mm×2mm的β-磷酸三钙24块用蒸馏水洗净，超声净化2次×20min，自然干燥，高压灭菌。VEGF165基因转染的MSCs经G418筛选后，将转染MSCs收集达到所需细胞密度（5×106），种植到β-TCP上。然后，MSCs-β-磷酸三钙复合体置入37℃、5%CO2孵箱，培养7天，隔日换液。

1.2.5 MSCs-β-磷酸三钙复合体异位种植：在全麻下将MSCs-β-磷酸三钙复合体各2块分别回植到每只大鼠背部的肌肉内，分别于4周、8周及12周各处死大鼠。植入标本经脱钙、浸蜡、透明、石蜡包埋、连续切片，厚度为5μm，制成组织切片标本，进行HE染色观察。

2结果

2.1 大鼠骨髓基质细胞的生物学特性：原代培养时，大鼠骨髓基质细胞生长稳定，增殖速度快。原代骨髓基质细胞于24～48h贴壁，开始为小的圆形细胞，培养6～7天时出现90%的融合，呈散在的集落状生长，并围绕集落中央呈岛状放射样排列(图1)。

2.2G418筛选的阳性细胞克隆：以pcDNA3.1-VEGF165转染骨髓骨髓基质细胞后24h，加入G418进行筛选。未转染的细胞在1 周内全部死亡；而转染的细胞2 周内10%～20%细胞存活，呈克隆状生长 (图2) 。

2.3MSCs与β-TCP植入体内的成骨特点：植入体内第4周，可见小骨岛，呈散在分布，在小骨岛的周围可见大量的成骨细胞，成骨细胞体积较大，形态不规则。未降解的β-磷酸三钙在脱钙时被溶解而余下空白区域(图3)。植入第8周，标本的成骨量增多，相互融合成片，成骨细胞被包埋在骨基质中，出现板层骨，血管紧贴在新生板层骨周围（图4）。植入后12周，移植材料逐渐被新生骨组织取代，成骨量明显增大，并有骨髓腔样结构出现，可见骨细胞胞体呈椭圆形，胞核较大，骨陷窝明显（图5）。

3讨论

如何在构建组织工程化骨组织的同时重建其血液供应成为骨组织工程从基础研究向临床应用过渡的关键性问题。目前有关骨组织工程血管化的研究尚处于起步阶段，主要方法有：①成骨细胞+血管内皮细胞+生物材料；②成骨细胞+生物材料+血管束植入；③成骨细胞+生物材料+筋膜瓣；④成骨细胞+生物材料+带血管蒂的组织瓣包埋等。Tsurumi等[3]应用VEGF真核表达质粒转染兔动脉壁，发现侧枝循环明显增加。Baumgartner等[4]进行VEGF基因治疗肢体缺血性疾病的临床试验，并取得了良好的效果。

研究表明，β-磷酸三钙（β-TCP）具有良好的骨引导活性，将其植入大鼠股骨上的骨缺损中，术后4天即有细胞侵入材料内部，术后1周时即有骨组织在材料周围形成，骨直接沉积在材料表面[5]。程晓兵等[6]将块状β-TCP埋入兔颅骨骨膜下，观察其在光滑的骨皮质表面的骨引导作用，结果表明，β-TCP具有良好的表面骨引导作用，新生骨与骨床结合良好。本研究中应用的 -TCP是由荷兰Isotis生物材料研究所提供的有孔磷酸钙陶瓷，平均孔径200μm，含孔率60%。该生物材料是细胞生长良好的载体，它与骨髓基质细胞的三维复合体植入体内后产生较好的异位骨形成能力。

本实验利用VEGF165的促进微血管生长的作用，将转染VEGF165的自体骨髓基质细胞作为种子细胞，与β-TCP复合后进行体内成骨能力研究。因转染细胞数量较少，需将未转染的骨髓基质细胞与转染细胞混合，以达到足够的细胞浓度（≥5×106/ml）。植入后4周，可见移植材料周围有大量的成骨细胞，并有少量的血管长入；植入后8周，血管紧贴在新生板层骨周围，成骨量明显增大，并有骨髓腔样结构。这些可以说明两个问题：①骨的形成过程与血管密切相关，如果没有血管的长入，植入的细胞就无法获得充分的营养供应，骨形成能力将会受到影响[7]；②转染VEGF165的骨髓基质细胞在体内生长的同时分泌VEGF165，而分泌的VEGF165促进微血管生长，使植入物周围的血管尽快长入材料中，从而加速骨形成的过程。MSCs转染VEGF165基因后植入体内后，可以发挥VEGF165的促血管生长作用，成为组织工程骨血管化探索的方向。但是，VEGF165基因参与成骨的量和方式以及血管化的过程仍需要深入研究。

[参考文献]

[1]Ferrara N, Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothellial cells [J]. Biochem Biophys Res commun, 1989, 161:851-855.

[2]高全文,董绍忠,杨连甲,等.人血管内皮生长因子165基因真核表达载体的构建及表达[J].细胞与分子免疫学杂志,2003,19(1):32-34.

[3]Tsurumi Y, Kearney M, Chen D, et al. Treatment of acute limb ischemia by intramuscular injection of vascular endothelial growth factor gene[J]. Circulation, 1997, 96(suppl Ⅱ):382-386.

[4]Baumgartner I, Pieczek A, Manor O, et al. Constitutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia[J]. Circulation, 1998, 97:1114-1119.

[5]高全文,杨连甲,梁立民,等.大鼠骨髓基质细胞与β-磷酸三钙体外复合培养[J].现代口腔医学杂志, 2006,20(2):155-156.

[6]程晓兵,薛振恂,周树夏,等. 多孔块状β-磷酸三钙陶瓷兔骨膜下埋置引导成骨的定量研究[J]. 实用口腔医学杂志, 1998, 14(4):256-258.

[7]王金明,章庆国,张娇.温固化水凝胶负载骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究[J].中国美容医学,2008,17(3):389-392.

[收稿日期]2008-08-21[修回日期]2008-12-15

编辑/张惠娟