青蒿琥酯钠对兔耳增生性瘢痕中肥大细胞的影响

李　伟　石崇荣　黄崇本　吴　一

[摘要]目的：探讨青蒿琥酯钠(Art)对兔耳增生性瘢痕中肥大细胞的影响。方法：用新西兰大白兔制作增生性瘢痕动物模型，兔左耳为Art组，用60mg/ml Art 20μl/瘢痕作局部注射，每隔2天1次，共5次；右耳作为对照组，用5%NaHCO320μl/瘢痕作局部注射。HE、VG染色观察成纤维细胞和胶原形态，甲苯胺蓝染色作肥大细胞计数。结果：HE和VG染色显示：Art组真皮层较薄，胶原纤维排列较整齐；对照组真皮层较厚，胶原排列紊乱，有漩涡状结构。肥大细胞计数Art组为（5.27±1.27）个/HP，对照组为（10.67±2.35）个/HP，两组比较差异有显著性意义。结论：青蒿琥酯钠能减少瘢痕中肥大细胞数量，抑制成纤维细胞增殖，减少胶原合成。

[关键字]青蒿琥酯钠；动物模型；增生性瘢痕；肥大细胞

[中图分类号]Q 813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）01-0066-03

Inhibiting effect of artesunate on mastocyte in rabbit ear hypertrophic scar

LI Wei1, SHI Chong-rong2, HUANG Chong-ben2, WU Yi1

(1.Department of Plastic Surgery,Chongqing Emergency Medical Center, Chongqing 400014; 2.Department of Burns and Plastic Surgery,the First Hospital Affiliated to Chongqing University of Medical Science,Chongqing 400016)

Abstract:ObjectiveTo probe into the inhibiting effect of Artesunate on Mastocyte in rabbit ear hypertrophic scar model.MethodsSix New Zealand rabbits were used to establish animal model for hypertrophic scar. The scars on the left ears were taken as Artesunate group receiving sodium Artesunate by local injection in a dose of 60mg/ml, 20μl pre scar every two days for 15 days. The scars on the right ears served as control group were treated with 5% sodium bicarbonate by local injection 20μl pre scar. After 15 days of treatment, the scars were harvested. HE and VG staining were used to observe the histomorphology of the fibroblasts and collagen fibers. Mastocyte were counted on Toluidine blue staining slide.ResultsOn gross examination,the hardness of the scars of the Artesunate group was lower than that of control group. The dermis of the Artesunate group was thinner than that of control group, the collagen was well-arranged in Artesunate group. HE and VG staining shown more fibroblasts and the collagen nodules could be found in control group. There was significant difference between the two groups in mastocyte counts(P<0.01).The mastocyte count of Artesunate group and control group were（5.27±1.27）/HP and（10.67±2.35）/HP respectively.ConclusionsIt shows Artesunate can inhibit fibroblast proliferation by reducing mastocyte and reduce collagen synthesis.

Key words: artesunate; animal model;hypertrophic scar;mastocyte

瘢痕的防治一直是医学界研究的热点，其手段主要有：手术切除、药物注射、压迫、硅胶贴膜、放射治疗等方法，但这些方法都各有不足之处。1987年孙顺仙发现青蒿素对实验性矽肺有明显的治疗作用以来，文献[1-3]对青蒿素及其衍生物抑制瘢痕形成的作用机理探讨日趋深入。肥大细胞在瘢痕中扮演重要角色，本实验旨在探讨青蒿素对瘢痕中肥大细胞的影响，进一步揭示青蒿素防治瘢痕的机理。

1材料和方法

1.1 动物模型的制作：选用健康成年新西兰大白兔6只（购自重庆医科大学动物实验中心），兔耳健全，雌雄不拘，体重2～2.5kg，分笼饲养。

动物瘢痕模型的制作参照Morris氏[4]方法并加以改良：用3%戊巴比妥钠1.5mg/kg作耳缘静脉麻醉，严格无菌操作技术下，在兔耳腹侧做1cm×1cm大小创面，去掉兔耳全层皮肤及软骨膜，创缘用烙铁烧灼，每只兔耳做6个相同创面。共72个创面，术后创面暴露，待创面自行愈合，一般需16～19天。

1.2 实验方法：待兔耳创面瘢痕形成后，取瘢痕标本做切片，HE和VG染色证实为瘢痕组织。兔耳创面上皮化后（术后19天），选择兔左耳瘢痕作为青蒿琥酯钠（Art）组，兔右耳瘢痕作为对照组（5%NaHCO3组）。Art组用青蒿琥酯钠（广西桂林第二制药厂惠赠）加5%NaHCO3配成60mg/ml，用微量注射器作局部瘢痕内注射，注射时从瘢痕周围的正常皮肤进针，注药量20μl/瘢痕。对照组用5%NaHCO3作局部瘢痕内注射，20μl/瘢痕。每隔2天1次，共5次。

1.3 观察指标：用药后15天，3%戊巴比妥钠1.5mg/kg作耳缘静脉麻醉，切取瘢痕标本。作HE、VG和甲苯胺蓝染色的标本用4%中性甲醛固定。

常规石蜡切片，厚约5μm，裱于经多聚赖氨酸及APES双重处理玻片上。脱蜡至水，HE染色，光镜观察并测量相对增高指数。VG染色观察胶原情况。甲苯胺蓝染色后光镜下观察并做肥大细胞计数。

1.4 统计方法：数据用SAS软件包作统计配对t检验。

2结果

2.1 大体观察：Art组兔耳瘢痕质地较柔软平整。对照组瘢痕增生明显，突起高于皮面。在×4低倍镜下用测微尺测量相对增生厚度：增生厚度指数HI=(b+a)/a【a兔耳腹侧皮肤厚度；b增生组织最大厚度】，见表1。

2.2HE和VG染色：对照组真皮层较厚，成纤维细胞数量多，胶原纤维致密粗大，排列紊乱，可见旋涡状结构和胶原结节（图1、2）。Art组真皮层较对照组薄，成纤维细胞数量较少，胶原较疏松，排列较整齐，未见胶原结节和旋涡状结构（图3、4）。

2.3肥大细胞染色：镜下可见肥大细胞颗粒呈红色，核呈蓝色，在高倍（40）镜下作肥大细胞计数（每张切片取上、下、中、左、右五个视野取平均数），对照组肥大细胞多见（图5），Art组肥大细胞数量较少（图6），结果见表2。

3讨论

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是人类特有的一种病理现象，创伤后机体将启动一系列修复程序，瘢痕形成是有多种细胞和细胞因子参与修复的过程。成纤维细胞合成多种细胞外基质，胶原的过度沉积、排列紊乱及大量的粘多糖堆积导致瘢痕的形成，肥大细胞和成纤维细胞的相互作用对瘢痕的形成有重要影响。

在增生性瘢痕组织中肥大细胞数量是正常组织的4倍[5]，从瘢痕到其周围正常皮肤可见肥大细胞逐渐由多到少[6]。Smith等[7]认为IgE介导的免疫反应参与了烧伤后瘢痕的形成，在IgE的启动下，肥大细胞脱颗粒释放组胺、肝素、嗜酸性粒细胞趋化因子、中性粒细胞趋化因子、慢反应物质、类胰蛋白酶等，肥大细胞数目及其颗粒同纤维化正相关[8-9]。

将肥大细胞和人肺成纤维细胞放在漂浮的I型胶原上共同培养发现[10]：肥大细胞能增强成纤维细胞的收缩性，并呈现时间和剂量依赖性，肥大细胞的活性能促使细胞外基质重塑，从而导致纤维化和组织功能障碍。肥大细胞能增强FPCL（成纤维细胞-聚集的胶原蛋白网络）收缩，其增强方式不依赖于肥大细胞释放的颗粒，而靠成纤维细胞和肥大细胞间的GJIC（缝隙连接介导的细胞间通讯）起作用[11]。

肥大细胞和3T3成纤维细胞共同培养时能显著促进成纤维细胞的增殖和胶原的合成，并且这种作用能被抗过敏药物奈多罗米钠（nedocromil sodium）所抑制[12]。肥大细胞分泌的丝氨酸蛋白酶能使成纤维细胞失去接触抑制，导致其增殖能力增强；NIH/3T3成纤维细胞能产生干细胞因子促进共同培养体系中肥大细胞增殖[13]。干细胞因子能上调肥大细胞对单核细胞趋化蛋白（MCP-1）的表达和合成，导致成纤维细胞对αⅠ型胶原mRNA的表达增强[14]。在低氧环境中，成纤维细胞和肥大细胞通过细胞接触相互作用能增强瘢痕中HIF-ａ1和 VEGF的表达[15]，以上研究表明成纤维细胞和肥大细胞之间存在双向调节作用。

肥大细胞同肌成纤维细胞有着密切的关系，常常聚集在一起，并且细胞之间直接接触，肥大细胞的的丝状伪足包绕于肌成纤维细胞质周围，肥大细胞释放的颗粒常常聚集成团，靠近脱颗粒肥大细胞的细胞基质中常含有大量的颗粒物质，而且肌成纤维细胞的粗面内质网高度扩张并有囊泡形成，肥大细胞和肌成纤维细胞之间的关系使肥大细胞及其释放的介质在病理性瘢痕的发病机制中起重要作用[16]。

肥大细胞脱颗粒释放组织胺和肝素等产物调节成纤维细胞的活性，具有促成纤维细胞增殖和血管生成的作用[17]。体内和体外实验证明肝素及其衍生物影响 -平滑肌动蛋白（ -SMA）的表达，增强成纤维细胞表达 -SMA，在瘢痕的演变中扮演重要角色。表达 -平滑肌动蛋白的成纤维细胞是肌成纤维细胞（MFB）的典型标志，MFB是一种非典型的成纤维细胞，在超微结构上具有成纤维细胞和平滑肌细胞的特性，具有合成细胞基质和收缩的功能。研究发现：组织胺和类胰蛋白酶能促进成纤维细胞增殖和胶原合成[18]，类胰蛋白酶是成纤维细胞的有丝分裂剂，具有促进成纤维细胞分裂增殖作用[9]。

本实验利用甲苯胺蓝对兔耳增生性瘢痕块染色，观察到肥大细胞位于真皮层，Art组肥大细胞数目为（5.27±1.27）个/高倍视野，对照组为（10.67±2.35）个/高倍视野，经统计差异有显著性意义（P<0.01）。Art组增生性瘢痕较对照组薄，成纤维细胞数量较少，胶原纤维排列较对照组整齐。结果表明青蒿琥酯钠能抑制肥大细胞增殖，减少肥大细胞产物，从而抑制成纤维细胞增殖和胶原的合成。

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[收稿日期]2008-08-26[修回日期]2008-12-03

编辑/张惠娟