表皮干细胞用于瘢痕治疗的研究进展

【文献标识码】B

【文章编号】1673－0364（2009）－06－0352－04

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.017

作者单位：200233上海市　上海交通大学医学院附属第六人民医院整形外科。

瘢痕组织是人体创伤修复过程中的自然产物。在正常的创伤愈合过程中，成纤维细胞合成和分泌以Ⅰ型胶原纤维为主的细胞外基质，胶原的合成代谢与降解代谢之间维持着平衡状态,无论是胶原合成的增加或者降解的减少都会导致胶原的大量堆积，最终导致增生性瘢痕或者瘢痕疙瘩的形成 [1，35]。主要合成和分泌胶原纤维的（肌）成纤维细胞 [2-3]，在细胞增殖和凋亡之间也维持着平衡状态 [4-5]。在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中这种平衡被破坏，（肌）成纤维细胞的增殖超过了凋亡，胶原的合成明显超过降解，最终导致大量的胶原堆积。导致这种变化的确切病因尚不清楚，但是在烧伤患者中，增生性瘢痕往往发生于延迟愈合的患者身上。采取了网状皮片移植的患者，常在没有表皮覆盖的肉芽组织间发生增生性瘢痕，在缺乏上皮覆盖的伤口，真皮内的成纤维细胞会分泌更多的细胞外基质。临床观察的结果提示，正常的表皮结构对于瘢痕形成有抑制作用。在皮肤损伤的修复过程中，表皮干细胞对于上皮的修复起着重要的作用，意味着表皮干细胞对于瘢痕的预防和治疗具有积极的意义。

表皮干细胞主要定位于毛囊外根鞘隆突部及皮肤基底细胞层 [10]，毛囊外根鞘隆突部是皮肤干细胞的主要栖存地。表皮干细胞不但对毛囊生长、修复和新陈代谢起关键作用，且对表皮损伤后的修复同样具有重要意义。表皮干细胞具有多向分化潜能，可分化为毛干、内髓鞘、外髓鞘、和皮肤表皮角质细胞以及皮脂腺等 [1]，创伤修复后的表皮细胞也来自于基底层干细胞或者周围附属器内的表皮干细胞的激活和增殖。目前，表皮干细胞的表面特异性标记物尚无定论，但较多采用一些细胞表面糖蛋白，如整合素家族的Integrinβ1和Integ鄄rinα6、角蛋白K19、基因物质P63等作为主要鉴定手段 [10]。近来发现表皮干细胞不仅是形成正常表皮增殖单位必不可少的来源，而且相关实验证实了表皮干细胞在创伤应激刺激后快速形成短暂增殖细胞，然后进一步形成角质细胞被快速募集至创面中心完成上皮化过程及创面修复。正常的上皮化过程对于伤口愈合十分重要，如果上皮化的持续时间超过3周，就会发生增生性瘢痕或者瘢痕疙瘩 [36]。

本文对表皮干细胞如何通过各种信号通路的调节影响修复的进程和结果，以及表皮干细胞如何通过上皮化作用影响伤口愈合而形成瘢痕等问题进行综述。

1　表皮干细胞参与创伤愈合的信号通路

1.1 Wnt信号通路

Wnt信号通路是动物的胚胎发育和组织器官形成时期的重要信号转导途径，主要通过细胞与细胞间的信号转导调节细胞增值、分化、凋亡及抗凋亡过程。Wnt信号通路主要指经典Wnt信号通路，即Wnt/β-catenine信号通路和10个非经典的Wnt信号通路：Wnt/PCP（Planar cell polarity）信号通路，Wnt-cGMP、Ca 2+信号通路，Wnt-RAP1信号通路，Wnt-ROR2信号通路，Wnt-PKA信号通路，Wnt-GSK3-MT（Microtubule)信号通路，Wnt-aPKC信号通路，Wnt-RYK信号通路，WntmTOR信号通路等 [46-47]。Wnt在细胞膜上有两种受体：Frizzled受体和脂蛋白受体。细胞外的Wnt蛋白与细胞膜上的受体结合之后，受体在磷酸化后通过下调GSK3β将信号传递到细胞内，解除APC蛋白、糖原合成激酶（GSK-3β)、轴素(Axin)、蛋白酶复合体体对β-连环蛋白的抑制，活化之后的β-连环蛋白进入细胞核，与Lef/Tcf家族的转录因子结合，从而激活转录因子，进一步激活靶基因开始转录。通常情况下，成体哺乳动物的Wnt基因在机体中处于静息状态；皮肤损伤时，激活了深层皮肤，Wnt基因表达Wnt蛋白，Wnt蛋白激活隆突部的表皮干细胞使其增殖、分化以实现皮肤损伤的修复 [48]。

Fathke等 [49]在伤口局部使用氯化锂抑制糖原合酶激酶3GSK-3β使β-catinen积聚，从而增强Wnt信号通路表达，发现毛囊间表皮细胞再生模式被改变，表皮创伤愈合面形成包含有毛囊结构和皮脂腺结构表皮囊肿。这说明表皮细胞在受到增强的Wnt信号诱导后可以转化为类似毛囊的形态，是Wnt信号决定了皮肤细胞分化的方向。在细胞核内，Lef/Tcf家族不同的因子在通路中发挥不同作用，在正常毛囊干细胞中，Tcf3的表达被抑制而正常表达Lef1，Lef1与β-catinen协同作用促使短暂增殖细胞进一步分化形成内毛根鞘。当毛囊干细胞内β-catinen在胞质表达稳定时，Tcf3的抑制被解除，毛囊干细胞被激活，分化并参与毛囊和表皮的增殖再生 [50]。

1.2 FGF信号通路

FGF家族成员拥有由大约120个同源氨基酸残基序列组成的核心区域，FGF受体为络氨酸激酶受体，分为FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4等亚型，各亚型都具有细胞外的免疫球蛋白样结构域和细胞内的络氨酸激酶结构域。FGF与硫酸乙酰肝素粘多糖紧密结合后，与细胞膜上的络氨酸激酶受体结合，受体形成二聚体，细胞内的络氨酸激酶活化，受体自身启动磷酸化过程 [51]。活化的受体通过FRS2-GRB2-GAB1-PI3KAKT信号级联放大通路，最终下调GSK3β的表达，解除βcatenin的抑制，活化后的β-连环蛋白进入细胞核，与Lef/Tcf家族的转录因子结合，从而激活转录因子，进一步激活靶基因转录。FGF信号通路通过该途径与Wnt信号途径相互作用，调节毛囊中表皮干细胞的分化方向，在创伤修复中起重要作用。

FGF最初是作为成纤维细胞或上皮细胞生成促进因子被发现的，现已明确它们在脊椎动物胚胎形成过程具有调节干细胞发育方向的功能。Stern等 [52]使用外源性方法阻断小鼠胚胎发育中的外胚层对成纤维生长因子（FGFs）的反应，没有FGFs表达的细胞中骨形成蛋白（MBPs）的表达增强，促使神经外胚层向神经分化受抑制，而分化成胚胎表皮。Kawano等 [53-54]对小鼠全层皮肤中的mRNA进行定量分析以了解FGF家族的22个成员及其受体的表达情况，发现FGF1、FGF2、FGF5、FGF7、FGF10、FGF13、FGF18、FGF22在皮肤中表达于毛囊增殖周期的不同阶段，不同的FGF有着不同的表达高峰，其中FGF18能促进体外培养的人成纤维细胞、毛囊隆突细胞、表皮角质细胞和血管内皮细胞的DNA合成，对毛囊形成及毛囊干细胞参与创面修复过程有重要促进作用。应用RT-PCR和原位杂交检测发现，FGF13 mRNA在毛囊再生和创伤修复中表达水平增高，免疫组化检测提示FGF13蛋白仅在毛囊隆突区域表达。FGF13可能在调节毛囊bulge细胞以及表皮基底层细胞的功能上发挥作用

1.3 BMP/TGF-β信号通路

骨形态发生蛋白（BMPs）是TGF-β超家族成员中最大的一族，通过调节一群广泛多样的基因活性，控制着机体组织器官的基本发育过程。BMPs与BMPⅡ型受体结合，Ⅱ型受体其胞质段的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域活性升高，能持续作用使Ⅱ型受体磷酸化Ⅰ型受体，磷酸化后的Ⅰ型受体又能使转录因子Smad磷酸化，并与Smad结合构成复合物进入核内，启动下游靶基因的表达 [55]。Smads蛋白是TGF-β1家族传递受体信号到细胞核内的细胞内信号转导分子，是目前所知唯一的激酶受体激活后在细胞内的底物。受体激活型Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，可被Ⅰ型受体特异的丝氨酸激酶磷酸化而活化，然后才能与Co-Smad（即Smad4）结合并形成复合物，转移到核内调控转录。Smad6和Smad7属于抑制性Smads，可与活化的Ⅰ型受体竞争性结合，阻止其他类型Smads的磷酸化，从而抑制信号转导 [56]。

在毛囊增殖周期中，处于真皮中的BMP2、BMP4也随之发生周期性改变，在毛囊的退行期BMP2、BMP4呈高表达，在毛囊周期的恒定增殖期却处于低表达水平，这正好与Wnt/β-catinen在毛囊周期中相同时期的表达相反。BMP在毛囊干细胞周围的稳定表达可维持毛囊干细胞的静息状态，阻止了毛囊干细胞的激活，却可以促进毛囊角质细胞的进一步分化而促使毛囊分化成熟 [57]。Smad4主要通过激活细胞凋亡通路来维持TGF信号诱导毛囊进入退行期，BMP和Wnt/β-catinen两条信号通路相互制衡以调节毛囊干细胞毛囊周期和表皮再生。

1.4 Notch信号通路

Notch基因编码一种膜蛋白受体，它的两种膜蛋白配体Delta和Serrate表达在相邻细胞的细胞膜上。当配体和Notch的胞膜外区结合时，Notch的胞内区(Intracellular domain of Notch，ICN)被金属蛋白酶（MMP）或γ分泌酶切割，脱离细胞膜成为具有活性的游离状态。活化的ICN被转运入细胞核并与Su（H）（Suppressor of Hairless）即RBP-Jκ结合，Su（H）单独存在时是一种抑制性的转录因子，ICN的结合使Su（H）转变为转录激活子，激活Notch诱导基因（Notch2 inducible genes）的转录。ICN-Su（H）复合物直接诱导转录的靶基因是E（spl）（Enhancer of Split），E（spl）是碱性螺旋-环-螺旋（basic helix2loop2helix，bHLH）类转录因子，它又调节其他与细胞分化直接相关的基因的转录 [64]。Notch信号通路通过参与Wnt信号的下游通路决定着表皮干细胞的分化方向。

其他调节表皮干细胞参与创伤修复的信号通路还有MAPK通路、钙粘蛋白-NFATc1-CDK4通路等，它们之间具有复杂的交联关系，在毛囊干细胞参与创伤修复的过程中相互联系构成一个网络系统。毛囊干细胞通过一系列复杂的调节最终完成伤口的上皮化。研究结果表明，阻断通路的某些步骤或者改变某些关键信号分子的含量，可以实现对于表皮干细胞分化的调控，而有望实现创伤无瘢痕愈合。

2　上皮化过程对于成纤维细胞的影响

创伤的愈合过程分为3个阶段：炎症反应阶段、增殖阶段以及塑形阶段 [6-7]。在伤口的上皮化过程中，根据伤口深度的不同，上皮化的方式有所不同。如果皮肤的基底层是完整的，缺损的表皮由皮肤基底细胞层内的表皮干细胞以自下向上分化增殖的方式进行修复。如果皮肤的基底层受到破坏，伤口则由伤口边缘附属器内的表皮干细胞向伤口方向分化、增殖、迁移而进行修复 [8-10]。

正常的上皮化过程对于伤口的正常愈合十分重要，如果上皮化的持续时间超过3周，就会发生增生性瘢痕或者瘢痕疙瘩 [36]，表皮细胞在表皮化的过程中受到来自表皮细胞自身以及真皮层的多重调节。表皮细胞迁移、增值、分化的过程通过可溶性的细胞因子以旁分泌、自身分泌的形式相互作用 [14]。伤口形成之后，表皮细胞分泌储存的IL-1α，IL-1α活化成纤维细胞和邻近的表皮细胞，趋化内皮细胞和淋巴细胞到创伤区域 [15]。成纤维细胞依次分泌FGF7、GM-CSF，进一步活化基底层附近的表皮细胞，活化过程同时受到来自创面的巨细胞、表皮细胞、单核细胞、巨噬细胞所分泌的TNF-α EGF家族（TGF-a、EGF、HG-EGF）、CXCL8和IFN-g的调控 [15-16]。在伤口正常上皮化过程结束后活化停止，但是在增生性瘢痕中表皮细胞在上皮化结束后仍然处于活化状态 [17-19]。受伤后24 h，表皮细胞在巨噬细胞、成纤维细胞、表皮细胞分泌的TGF-b1、HB-EGF、EGF、TGF-a、HGF、NGF、FGF7、VEGF、CXCL1、IL-6 和GM-CSF作用下开始增殖 [20-22]。没有来自于成纤维细胞的信号，表皮细胞无法形成具有功能的上皮 [23]。增殖阶段结束后，表皮细胞在FGF7和GM-CSF刺激下开始分化 [24]。与愈合早期不同，在愈合终末期，成纤维细胞分泌的TGF-β诱导表皮细胞由活化状态转化为失活状态 [15]，失活的表皮细胞又诱导成纤维细胞减少胶原的生成 [25-26]。和正常瘢痕组织内的表皮细胞相比，增生性瘢痕内表皮细胞的增殖和分化能力都有不同程度的提高 [18，27]。活性增强的表皮细胞减少了IL-1的分泌并提高PDGF的表达，从而直接促进了成纤维细胞胶原的合成与分泌 [28]。在体外联合细胞培养中，瘢痕疙瘩来源的活化的成纤维细胞可以诱导正常皮肤的成纤维细胞大量合成CTFG、TGF-β、VEGF [39-31]，并且促进胶原合成与分泌 [32-33]。

3　干细胞应用于瘢痕治疗的研究进展

表皮干细胞的增殖分化行为，一方面被细胞本身所预先程序化，另一方面又受其所处的微环境（干细胞壁龛）的影响，即干细胞壁龛通过细胞与细胞、细胞与细胞外基质两种方式调控干细胞的增殖分化，细胞因子在传递细胞与细胞外基质之间、细胞与细胞之间的信息中起重要作用，细胞外基质成分，如纤维结合蛋白、层黏连蛋白以及不同类型的胶原等均参与了表皮干细胞特征的维持及其增殖、分化等生物学行为的调控 [40]。

表皮干细胞在瘢痕治疗方面的研究及应用进展主要集中在两个方面。

①应用EGF促进伤口原位的表皮干细胞生长，加速上皮化的过程。

表皮干细胞在伤口上皮化过程中起着重要作用。许多调节因子，例如细胞因子、生长因子诱导并且调节伤口原位表皮干细胞的聚集、增殖和分化，以此促进伤口上皮化和伤口愈合。Ghalbzouri等 [41]用手术刀在皮肤（HSE）上制造全层损伤，部分创面给予外源性生长因子，观察伤口上皮化的速度。实验结果表明：表皮生长因子（EGF）的表达可以促进角质化细胞的迁移和增殖，进而加速伤口的上皮化过程。单细胞层伤口的愈合速度取决于细胞数量的增加。另有实验表明：外源性的表皮生长因子(EGF)可以提高单个细胞的运动能力，促进单层伤口的愈合速度 [42]。

黄晖等 [38]发现，感觉神经肽P物质能明显加速创面愈合速度，并具有诱导表皮干细胞向创缘集中和向创面肉芽组织中迁移的作用。付小兵等 [39]报道，表皮细胞生长因子可通过诱导皮肤干细胞增殖、分化而加速受创表皮再生；而经重组人表皮细胞生长因子治疗的慢性皮肤溃疡，在修复创面过程中，可见表皮棘细胞层有少量表皮干细胞岛，初步认为可能是由成熟的表皮细胞逆分化而来，其中EGF是一个重要的诱导因素。这一结果不仅使人们对EGF促进创面愈合的机制产生了新认识，而且可能为将来利用表皮干细胞进行皮肤功能性修复提供了新思路。

除了外源性生长因子对于上皮化的促进作用，相关研究表明伤口附近的角质化细胞分泌的内源性生长因子和细胞因子可以加速伤口上皮化的过程。Myers等 [21]的研究认为，提高伤口处生长因子和细胞因子的表达水平，可以活化毛囊和表皮内的表皮干细胞，加快上皮化，最终促进伤口的愈合。

②利用表皮干细胞通过组织工程技术构建组织工程皮肤，覆盖伤口以加速上皮化。

大面积烧伤患者，往往采用创面断层皮片移植的方法覆盖创面，以促进伤口愈合并减少瘢痕形成。但是自体取皮会造成供皮区损伤，而且还存在着供区不足的问题 [43]。利用患者自身的表皮细胞进行培养，形成连续的大张表皮之后，将其从培养皿上小心取下，直接覆盖于烧伤或者溃疡伤口表面 [44]，这种方法培养时间过长，而且培养获得的表皮比较脆，表皮与伤口的粘附效果亦欠佳。利用组织工程技术，在体外将大量培养的表皮干细胞种植在富含成纤维细胞的胶原海绵表面，构建组织工程皮肤，并移植到裸鼠皮肤的全层伤口处覆盖伤口，结果显示，经此处理的伤口比未经处理的伤口愈合快，瘢痕也较轻微 [46]。

4　展望

随着表皮干细胞研究的深入，应用表皮干细胞治疗增生性瘢痕以及瘢痕疙瘩有着广阔前景，但是调节表皮干细胞分化的通路十分复杂，利用调节通路的方法实现创伤无瘢痕愈合等问题仍需更深入的研究。临床应用前必须解决在体外快速、足量获得干细胞的问题，将来能够通过分离、纯化表皮干细胞，精度调控其增殖分化以及关键信号通路等手段实现创面的无瘢痕愈合。