灯冰注射液对家兔血小板聚集功能的影响

　　摘要：目的：研究灯冰注射液对血小板聚集率的影响。方法：家兔耳缘静脉注射灯冰注射液及体外给药，用比浊法检测家兔血小板在不同的诱导剂作用下的聚集率。结果：灯冰注射液注射给药能降低二磷酸腺苷(ADP)、血小板活化因子(PAF)、花生四烯酸(AA)诱导的血小板聚集率；体外给药能降低ADP诱导的血小板聚集率。结论：灯冰注射液具有抑制血小板聚集的作用。
　　关键词：灯冰注射液；血小板聚集；二磷酸腺苷；血小板活化因子；花生四烯酸
　　中图分类号：R285.5
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-2349(2008)02-0036-03
　　
　　灯冰注射液(DBI)由灯盏花素与冰片组成的新的中药复方制剂，具有开窍、活血祛瘀、止痛的作用，用于心肌缺血、中风及其后遗症等疾病的治疗。上述疾病中，血小板的过度活化是其重要的因素之一，表现为血小板聚集、粘附率及血小板内活性物质释放增加。本试验观察了DBI对血小板聚集功能的影响。
　　
　　1、材料与方法
　　
　　1、1药物
　　灯冰注射液，100ml.瓶^-1，批号20060405，由南京中医药大学中医药研究院植物药中心提供；阳性对照药：阿斯匹林，25mg，片^-1，批号040506，南京恒生制药厂生产。
　　
　　1、2动物
　　大耳白家兔，体重2.0～2.5kg，雄性，由南京江宁县汤山青龙山动物繁殖场提供，实验动物生产许可证：SCXK(苏)2002-0027，实验动物使用许可证：SYXK(苏)2005-0009。
　　
　　1、3试剂
　　血小板活化因子(PAF)：规格1mg/支，批号74389-68-7，由sigma公司生产；二磷酸腺苷(ADP)：规格0.5g，瓶^-1，批号：990527，上海伯奥生物科技有限公司；花生四烯酸(AA)：规格100mg，瓶^-1，批号：044K1372，由sigma公司生产；柠檬酸三钠：规格500g.瓶^-1，批号030413，AR，上海凌峰化学试剂有限公司、常熟市永华精细化学品有限公司生产。
　　
　　1、4仪器
　　PAPER-I型血小板聚集及血凝测定仪，北京世帝科学仪器公司生产；LDZ5-2离心机，北京医用离心机厂生产。
　　
　　1、5方法
　　1、5、1家兔在体血小板聚集实验家兔30只，随机分为5组：正常对照组(耳缘静脉注射等容积生理盐水)；阳性对照组阿斯匹林(3.5mg.kg^-1)灌胃给药；DBI高剂量(4mg.kg^-1)、中剂量(2mg.kg^-1)、低剂量(1mg.kg^-1)耳缘静脉注射给药。每日1次，连续3d。血小板聚集率检测：参照文献方法，于第3d给药后20min(阳性对照组于给药后60min)颈动脉取血，枸橼酸钠(3.8％)1：9抗凝，以1000r.min^-1离心10r.min^-1，取富血小板血浆(PRP)，剩余部分以3000r.min^-1离心，取贫血小板血浆(PPP)，聚集诱导剂用PAF(终浓度0.38μg/ml^-1)、ADP(终浓度5.54μg.ml^-1)、AA(终浓度76.90μg.ml^-1)。用PAPER-I型血小板聚集及血凝测定仪测定血小板1min、5min、max聚集率，并按下述公式计算抑制率。血小板聚集抑制率(％)=(对照组血小板聚集率－给药组血小板聚集率)／对照组血小板聚集率×100
　　1、5、2家兔体外血小板聚集率测定方法　 大耳白家兔，雄性，用利多卡因局部麻醉，颈动脉插管放血，3.8％的枸橼酸钠1：9抗凝，以1000r.min^-1离心10min，取富血小板血浆(PRP)，剩余部分以3000r.min^-1离心，取贫血小板血浆(PPP)，聚集诱导剂用ADP(终浓度5.54μg.ml^-1)。每管250μl PRP中加入不同浓度的药物10μl，对照组PRP中加入生理盐水10ul，37℃温育5min，然后加入5.54μg，ml^-1的ADP10μl，检测血小板聚集率，并计算药物的半数抑制浓度(IC)。
　　
　　1、6统计学方法
　　实验数据以x±s表示；使用SPSS11.5统计软件，进行方差分析(q检验)。
　　
　　2、结果
　　
　　2、1 DBI对AA诱导的家兔在体血小板聚集率的影响　 与空白对照组比较，DBI耳缘静脉给药高、中、低3个剂量均能显著抑制AA诱导的家兔血小板的最大聚集率，对1min、5min的聚集率也有不同程度的抑制作用；但较阳性药阿司匹林组弱，见表1。
　　
　　
　　2、2 DBI对ADP诱导的家兔在体血小板聚集率的影响　 与空白对照组比较，DBI静脉给药高、中、低3个剂量均能明显抑制ADP诱导的家兔血小板的1min及最大聚集率，高、中剂量对5min聚集率有显著的抑制作用；与阳性药阿司匹林组比较，高、中、低3个剂量对1min时的血小板聚集率无显著性差异，高剂量组的最大聚集率也无显著性差异，见表2。
　　
　　
　　2、3 DBI对PAF诱导的家兔在体血小板聚集率的影响　 与空白组比较，DBI静脉给药高、中、低3个剂量均能明显抑制PAF诱导的家兔血小板的1min、5min及最大聚集率；与阿司匹林组比较，DBI高剂量组对1min、5min及最大聚集率与阿司匹林组均无显著的差异，见表3。
　　
　　
　　2、4 DBI对ADP诱导的家兔体外血小板聚集率的影响　 体外给药DBI终浓度为296.3μg.ml^-1、148.15μg.ml^-1、74.07μg.ml^-1对家兔血小板的最大聚集率均有明显的抑制作用。且作用与剂量间呈依赖关系：y=-0.0373x+45.516；r=0.9699，见表4、图1。
　　
　　
　　3、讨论
　　
　　血小板是一种多功能细胞，具有粘附、聚集和释放功能，在血栓形成与止血过程中起着重要作用。心肌缺血、脑梗塞等心脑血管疾病均具有血小板聚集释放功能亢进、血小板聚集率增高等现象。本试验结果表明：DBI注射给药对ADP、PAF、AA诱导血小板聚集均具有不同程度的抑制作用，体外也有抑制ADP诱导的血小板聚集作用，这可能是其治疗心肌缺血、脑梗塞及其后遗症等心脑血管疾病的作用途径之一。
　　ADP、AA、PAF是体内的活性物质。血小板聚集主要存在ADP、血栓素A(TXA)与血小板激活因子(PAF)三条途径。ADP通过和血小板膜表面上的特异性受体的结合，增加三磷酸肌醇(IP)量，动员胞内贮存的钙离子(Ca²⁺)释放到细胞质中，使胞内Ca²⁺浓度升高，而使血小板活化，引起血小板粘附、聚集。在组织缺血时，受损组织释放出AA，通过环氧化酶途径转变为前列腺素环内过氧化物(PGG，PGH)，进而增加血栓素A(TXA)的生成。在脑梗塞、心肌梗死患者中，PAF的产生是明显增加的。在上述血小板活化途径中，ADP促进TXA生成，而TXA与PAF可进一步促进ADP释放，因此ADP途径居于重要地位。本实验观察到DBI对ADP诱导的血小板聚集抑制作用比AA、PAF诱导的血小板聚集抑制作用强，且对ADP诱导体外血小板聚集亦有抑制作用，并具有明显的量效关系，提示DBI抑制血小板聚集作用可能主要通过ADP途径，但究竟是影响血小板膜上ADP受体，还是影响血小板内颗粒成分的释放，尚待进一步研