ＳＳＲ分子标记技术在入侵昆虫学研究中的运用

刘佳妮等

摘要：外来入侵生物通过与本地生物竞争营养、水分和生存空间，造成严重的生态破坏和生物污染，最终导致生物多样性的丧失，逐渐成为人类生存和社会可持续发展的新威胁。简单序列重复(simple sequence repeats，SSRs)或微卫星DNA分子标记是生物群体遗传结构分析与变异研究中极有价值的分子标记，由于其具有多态性检出率高、信息含量大、共显性标记、实验操作简单、结果稳定可靠等优点，目前在外来入侵生物研究中得到广泛应用。本文概述了SSR分子标记在入侵昆虫来源鉴定、杂交和基因渗透、瓶颈效应等方面的应用进展，并对其在入侵生物学中的应用前景进行了展望。

关键词：简单系列重复；微卫星DNA；入侵昆虫；外来入侵生物

中图分类号：Q75

遗传标记是研究生物遗传变异规律及其物质基础的重要手段，是检验遗传多样性的有效方法。随着分子生物技术的发展，分子标记成为一种比较理想的新型遗传标记形式。它直接在DNA水平上进行操作，通过一定方式或特殊手段来反映生物个体或种群之间具有差异性状的DNA片段，因而比传统的形态学、细胞学和生物化学方法更为直接和准确，可有效提供有关外来物种入侵路径及其遗传变异程度的相关信息，有助于更好地了解入侵物种的繁育系统，决定入侵生物的入侵来源，提供更为准确的分类依据。SSR(simple sequence repeats)简单序列重复或微卫星DNA(microsatellite DNA)，又称短串联重复序列(short tandam repeats，STR)或简单序列长度多态性(simple sequence lengthpolymorphism，SSLP)，是指一类由少数几个核苷酸(一般1～6个，多数为2～4个)为重复单位组成的简单串联重复DNA序列，如(TG)n，(AAT)n，(CATA)n等广泛分布于真核生物基因组中。其重复单位短，重复数可变，种类多、分布广，是一种最富信息和多态性的系列标记位点。由于SSR标记具有共显性遗传特性，故可鉴别杂合子和纯合子；且这一标记具有多态性高、遗传信息量较大、实验程序简单、快速、稳定性高、重复性好等优点，因此是一种很有价值的分子标记。近年来，SSR标记已广泛应用于入侵昆虫种群来源鉴定、瓶颈效应、杂交和基因渗透、入侵因素等方面的研究。

1、SSR分子标记的原理及特点

1.1SSR标记的基本原理

微卫星DNA广泛存在于各种真核生物的基因组中，而且分布较均匀，平均每10 kb的DNA序列中就会出现一个微卫星序列。目前认为微卫星丰富的多态性或者与DNA重组过程中的不等交换有关，或者与DNA复制过程中的“滑链错配”(slippedstrand mispairing)有关。鉴于微卫星DNA序列具有高度保守性和专一性，可以使其特异地定位于染色体的某一位置，然后用与两侧保守的DNA序列互补的方式设计出特定的寡核苷酸引物，通过特异性引物对基因组DNA进行PCR扩增，然后将扩增产物在高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳和放射自显影(银染)上加以分离，从而检测到在简单系列重复中由于重复的次数不同以及重复的程度不一致而造成这些序列的多态性，即检测出了不同个体在每个微卫星座位上遗传结构的差别。

1.2SSR标记的技术特点

SSR分子遗传标记一般分为单位点分子遗传标记和多位点分子遗传标记。目前提到的微卫星遗传标记一般是指单位点分子遗传标记，其主要特点有：(1)SSR位点呈孟德尔共显性遗传模式，可以区别纯合显性个体和杂合显性个体，为遗传学研究提供了更多的可供分析的信息。(2)SSR标记在数量方面没有生物学上的限制，其标记带型简单，记录的条带一致、客观、明确，采用PCR技术进行检测只需少量DNA样品，且质量要求不高，即使是部分降解的样品也可进行分析，每个位点均有许多等位形式，能检测到多等位基因位点。(3)SSR位点具有高度的多态性，遗传信息量较大、实验程序简单、快速、稳定性高、重复性好等优点。(4)SSR位点的最大优点之一在于其等位基因的多样性，这对于遗传标记来说是非常重要的。相比于表形标记，SSR分子遗传标记不受生物发育时期和“环境”的影响，为“中性”标记，能够更加客观地反映生物之间的本质差异，从而能更加客观地反映生物的种群结构和进化历史。

1.3SSR标记引物的开发

1.3.1传统的SSR分子标记开发

先制备基因组DNA片段，筛选较小DNA片段，连接载体并转化大肠杆菌，构建基因组文库。用人工合成带放射性同位素或非放射性标记的SSR探针进行Southern杂交，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序，根据测序结果，设计SSR引物。该方法简单，易掌握，但必须对每个克隆进行筛选鉴定，需花费大量人力、财力，而且效率较低。

1.3.2微卫星富集法

为了提高SSR的克隆率，有人又想出另外的方法一建立和筛选微卫星富集文库。主要有两种方法：一种是用含微卫星序列的PCR引物进行PCR富集，另一种是用含微卫星序列的探针进行杂交富集。其实质是在筛选小插入片段基因组文库的基础上，再增加一次筛选。可以先用PCR富集，再用探针杂交筛选，也可以两次都用杂交筛选。经过这样两次筛选，获得SSR克隆的效率可大大提高。Brunner等在研究西花蓟马(Frankliniella occidentalis)的时候，用RsaⅠ限制性酶消化基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，试剂盒回收纯化300～700 bp的片段，并连接SNX-F和SNX-R序列后与质粒载体连接，转入大肠杆菌，构建基因组文库。进而转化，获得一个含小插入片段的基因组文库。用3个寡聚核苷酸(CA)₁₀、(CT)₁₀和(AAG)₈做探针与该文库杂交，将单链重组的标准引物M13转化于菌株，从130个克隆中测序得到6个微卫星位点。但该法获得有用序列的概率并不高，经常是测了很多序列，但由于插入片段太短、或SSR重复单元离插入末端太近、或侧翼序列中的二级结构太多，而不能用来设计高质量的引物，最终导致分离出来的SSR座位数太少。

1.3.3数据库搜索

近年来，随着基因组计划的开展和大规模测序工作的进行，互联网上GenBank、EMBL和DDBJ等公共数据库里登录的DNA序列和表达序列标签(expressed sequence tags，ESTs)越来越多。一方面，可用专门的SSR分析软件如Sputnik和Wisconsin GCG程序包中的FindPatterns程序搜索现成的公共数据库来发掘SSR序列。康芬芬等在研究橘小实蝇地理种群遗传多态性的时候，就直接搜索公共数据库获得了Dai等人开发的6个橘小实

蝇微卫星位点，提高了研究的效率。另一方面，可根据EST建立SSR标记，在通过一些软件(Phrap等)进行拼接和聚类去除一些冗余的EST，利用Repeatmasker和MISA等软件搜索SSR，根据返回结果分析EST中SSR的频率、特点和分布，然后选取目标SSR设计引物，即可通过PCR建立EST-SSR标记。这两种方法都极大地缩短了标记开发时间同时节省了大量经费，逐渐被越来越多的人所采用。

2、SSR标记在入侵昆虫研究中的运用

外来入侵物种的遗传结构组成通常受到其入侵来源、生活史特性及许多其他因素如奠基者效应、遗传漂变、种群年龄和大小、有性生殖程度、繁育系统、杂交以及环境异质性等等的影响。在众多的生物类群中，入侵昆虫由于具有钻蛀性，可以凭自身飞翔能力进行传播，抗逆性强，食性广，繁殖能力强等特点而在生物入侵中扮演了重要角色。

利用分子生物学的技术方法研究入侵昆虫种群动态的分子机制，寻求最基本、最快捷和最有效的种群遗传控制与生境管理相结合的管理方案是目前解决有害种群的入侵、扩张和暴发、资源种群的下降、濒危种群的保护等研究领域中的一个重要研究方向。SSR标记以其多态性高、遗传信息量大、实验程序简单、快速、稳定性高、重复性好等优点，在入侵昆虫的来源鉴定、杂交和基因渗透、瓶颈效应以及入侵因素，物种进化和系统发生等研究方面广泛应用，为外来生物生态学和种群学的研究和发展提供了新思路，为入侵生物的预防和控制提供理论依据。

2.1入侵昆虫来源的鉴定

外来物种的地理起源常常会影响其在新生境的入侵性。对入侵种群遗传结构特征的研究可揭示外来入侵种的起源问题，成功的入侵物种往往来自生物群区丰富的大陆。分析入侵昆虫的地理起源能加深对该入侵种来源的认识，为以后的防治寻找有效的天敌，了解其入侵后生物学变化具有重要的意义。

地中海实蝇(Ceratitis capitata)是具有较长入侵历史的农业重要害虫，在美国的不同地区都造成危害，但长期以来不能确定在过去采集的实蝇是来自入侵种群还是来自当地种群。Bonizzoni等用10个微卫星位点分析了1992—1998年间多次危害加利福尼亚地区的109头地中海实蝇，以及在夏威夷、危地马拉、萨尔瓦多、厄瓜多尔、巴西、阿根廷和秘鲁建立种群的242头地中海实蝇，结果表明一些从加利福尼亚捕获的地中海实蝇起源于独立的入侵事件，洛杉矶盆地地方种群可能起源于危地马拉。Paxton等使用微卫星标记分析了14个熊蜂群体，结果发现那些不是蜂王后代的外来蜂个体大约占整个群体的50％，从而为研究膜翅目社会性昆虫巢穴中的进化冲突在理论上提供了新的视野。阿根廷蚂蚁起源于南美洲，之后相继入侵了其他地中海气候的国家或地区，并大面积扩散使其成为一种世界性的重要入侵生物。Tsutsui等使用7个多态性SSR标记对南美洲阿根廷11个地点、巴西1个地点和入侵美国加州的17个地点(35巢穴)的阿根廷蚂蚁种群进行了分析，他们分别从不同种群遗传距离、个体的基因型以及等位基因数量差异3个方面探讨了加州阿根廷蚂蚁的入侵来源，结果表明阿根廷Rio Parana南部地区，尤其是Rosario地区和入侵加州的阿根廷蚂蚁的微卫星数据很相近。褚栋利用微卫星分子标记的方法分析了世界各地近30个烟粉虱种群的遗传结构，比较了入侵种群和原产地种群的差异，结果表明，我国的B型和Q型烟粉虱入侵种群与原产地种群比较，其杂合度没有显著降低，说明传人我国的初始种群数量很多，没有经历明显的瓶颈效应；根据不同种群的遗传距离、遗传分化程度以及基因交流的分析推测，我国B型烟粉虱的入侵来源具有多元化，主要有3个入侵来源：美国、地中海地区、澳大利亚。烟粉虱的传播以人为运输传播为主，自然传播为辅，应该注重烟粉虱的检疫，断绝其传播途径。

2.2瓶颈效应分析

当引入到一个新的环境后，外来物种往往伴随有奠基者效应(founder effect)，从而导致其种群水平的遗传多样性下降。非本地种从远距离区域被传入到新的区域后，初期定居者总是少数，即使少数个体能够形成一个小的种群，这个小种群仍然面临着很大的生存危机，这个阶段是生物入侵过程中种群发展的瓶颈时期。这个新种群的遗传组成就依赖于这些奠基者的遗传特性，如果这些奠基者不能代表它们母种群的特性，那么新建立的种群就有可能表现出遗传多样性的降低，称为奠基者效应，这种由于入侵生物的数量有限而引起新建立种群的遗传变异的减少的现象称为瓶颈效应(bottleneck effect)。

胡蜂起源于欧洲，后来入侵了美洲、南非、澳大利亚以及新西兰等多个国家和地区。1959年在澳大利亚的塔斯马尼亚岛发现了该胡蜂，Goodisman等利用3个多态性的SSR标记研究了澳大利亚大陆3个地区和塔斯马尼岛屿1个地区共141个巢穴1320头工蜂和376头雄蜂。不同种群的等位基因频率和Wrights F统计分析表明，4个地区种群产生了遗传分化，塔斯马尼亚岛种群与其他3个地区种群的遗传分化尤其显著，种群遗传相似性随着空间距离增加而降低，相隔超过25km的巢穴则属于不同的交配池，作者认为这样的遗传模式是由于胡蜂在澳大利亚定居过程中频繁经历瓶颈作用造成的。

阿根廷蚂蚁在原产地种群具有63个等位基因，但在入侵地只有29个；其中27个等位基因同样存在于原产地种群中，仅有2个是新出现的位点；同时表现出与原产地明显不同的种群特征。在原产地每个巢穴中仅存在一个蚁后，不同巢穴间有激烈的斗争，然而在入侵新的地区后阿根廷蚂蚁不同巢穴间的种内竞争明显较原产地削减，但种间竞争的能力却进一步得到加强，在同土著蚂蚁的争斗中占据了数量上的优势。目前，许多研究人员利用微卫星标记对阿根廷蚂蚁行为特性改变的遗传学基础进行了探讨。Tsutsui等用微卫星分子遗传标记对原产地阿根廷地区和入侵地加利福尼亚的阿根廷蚂蚁的种群遗传变异进行全面的比较，结果表明在入侵地区的阿根廷蚂蚁的等位基因的多样性和杂合性的水平都低于原产地阿根廷的种群，他们认为由于遗传瓶颈使得入侵种群同质性的增加，减少了入侵种群不同巢穴间的种内争斗，从而形成了有利于其入侵的行为特性。

2.3杂交及基因渗透研究

当入侵生物和当地生物存在杂交机会时，生物群落可能更加容易被入侵。通过杂交或者遗传同化，对远系繁殖的抑制可加速本地物种的消失，或群落遗传多样性的丢失，甚至会导致本地物种的灭绝。然而，许多成功入侵的物种在入侵过程中通过混合不同来源的遗传变异或通过与入侵地近缘物种杂交等途径提升了这些物种在入侵地的种群遗传多样性。杂交也可以将当地生物的基因引入入侵生物中，从而增加了入侵生物在新的环境中的适应性，

并且减缓入侵生物在建群过程中出现加性遗传变异的丢失，从而产生新的基因型。事实上，尽管杂交也产生了一些不适应特定环境的基因型，但其中有少量的基因要比其亲代更适合于特定的环境，所以，基因重组导致物种基因库的增大。

Stone和Sunnucks对400年前沿欧洲西行的一种瘿蜂(Cynipid gallwasps)进行了研究，发现其平均异合子随着与原产地距离的增加而逐渐减少，等位基因多样性也逐渐下降，反映了这种瘿蜂在逐渐西行的过程中发生了遗传多样性的丧失。总之，由于微卫星DNA具有许多等价基因并且表现出高度的杂合性，在用其对昆虫进行种群间的遗传测量时，都表现出了高度的有效性。

2.4遗传结构及遗传多样性

微卫星的突变速率在不同物种、同一物种的不同位点甚至在同一位点的不同等位基因间都存在着较大的差异，因此，微卫星具有高度的遗传多态性。通过分析微卫星多态位点的比率及杂合度，可了解昆虫种群的遗传多样性，从而进一步分析昆虫的群体遗传结构。Lehmann等分别用同工酶和SSR两种遗传标记计算东非和西非的冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)不同地理种群的基因流，结果均很好地反映出种群的遗传分化，但SSR标记比同工酶的灵敏度要更高一些。Kamau等用SSR标记技术研究冈比亚按蚊时发现，由于地理隔离使得种群与种群之间缺少基因交流，从而导致了按蚊种群的分化。由于微卫星标记是共显性标记，许多等位基因表现出高度的杂合性，并且遵循孟德尔式遗传法则，利用微卫星标记来研究昆虫种群间和种群内的遗传特性，可以得到丰富的遗传多样性信息。

3、展望

在21世纪经济全球化、国际贸易一体化的新形势下，外来危险生物入侵所引起的生物安全问题已成为各国国家安全的重要组成部分。我国是一个农业大国，正处于传统农业向现代农业的转型过程中，外来有害生物的入侵在农业转型及生产中的问题越来越突出，已对我国经济持续发展和生态安全构成了严重威胁，我国面临外来有害生物入侵的压力也越来越大。外来物种的入侵机制研究一直是入侵生物学研究的热点。研究结果表明生物入侵的机制是高度复杂多样的，没有一般通用的模式。从分子水平来研究生物的适应、竞争等成功入侵因素的遗传学基础，是未来研究工作的重点和难点。

SSR标记由于高度稳定，具有丰富的多态性，在全基因组的分布较均匀，且绝大多数位于非编码区，不转录、不编码蛋白质以及RNA不受选择压力的影响。其独特的优点在入侵生物学中已经得到了广泛应用并取得了许多成果。但是，该技术在运用过程中也受到一些因素的制约：首先是微卫星的筛选过程繁杂；其次是对微卫星DNA的检测需要高分辨率的检测方法，理论上最高分辨率应能够分辨出一个碱基的差别。目前常用的PAGE银染技术虽能达到这个要求，但过程复杂，这就给大样本量的检测带来了困难。此外，PCR引物在不同物种间保守性较差，因此对于不同物种要进行特异性引物设计，这无疑需要投入大量的人力和物力。尽管如此，SSR标记由于能够提供更多的遗传信息，在入侵生物种群的相关研究，如种群的同质性、基因流的程度、遗传分化或边缘地区种群的生殖隔离以及新建立的入侵种群特性等方面具有很大的应用潜力。